Вступление

     Ротавирусы, представители одноимённого рода семейства Reoviridae были открыты уже более 60 лет назад, однако, вызываемые ими гастроэнтериты остаются актуальными до сих пор. Согласно классификации, ротавирусы разделены на 7 групп - А, В, С, Д, Е, F, и G, антигенно не связанных друг с другом. При этом, заболевания  у людей  и животных могут  вызывать представители первых трёх групп, а остальные обнаруживаются только у животных.

     Геном всех вирусов этого семейства представлен уникальной двунитчатой сегментированной РНК, разделяющейся  при  электрофорезе (ЭФ) на  сегменты, причём у реовирусов их  10, а у  ротавирусов-11 [7]. Ещё одной  важной и  уникальной особенностью ротавирусов, в отличие от всех остальных представителей семейства, является их потребность в трипсине, без которого воспроизводство вирусного потомства невозможно [4].

     Ротавирусы  группы А (рис. 1), возбудители вирусной инфекции с ярко выражен-ной сезонностью (ноябрь-март), играют ведущую роль в  кишечной  патологии, особенно  у детей  до 2-х лет,  являясь  причиной  возникновения  от  45 до 50%   всех  ГЭ  инфекционной  природы [1-6].

Рисунок 1. Электронномикроскопическая фотография: ротавирусы человека группы А. Негативное контрастирование. Ув. 200 000. Препарат Колпакова С. А.

Ротавирусы групп В  и С выглядят на этом  фоне  значительно скромнее - на их долю приходится от 3-х до 8% вирусных ГЭ [8].

      Целью  настоящей работы  была адаптация ротавирусов человека  к росту в  перевиваемой культуре клеток для  создания на их основе диагностических тест-систем, а также для изучения возможности применения адаптированных штаммов ротавируса человека  в качестве вакцинных.

Материалы и методы

      Культуры клеток. В работе использовали культуру перевиваемых клеток эмбриона свиньи (СПЭВ), культивируемую на среде 199  с добавлением  10% сыворотки  крупного рогатого скота (КРС).

     Вирусы. Фекальные 10 % суспензии готовили по обычной методике. Перед заражением клетки три раза промывали раствором Хенкса и наслаивали предварительно обработанные  0,25%  раствором  трипсина  суспензии фекалий больных детей, в которых  методом электронной микроскопии (ЭМ) были обнаружены ротавирусы. После  контакта  восстанавливали первоначальный  объём питательной средой  без сыворотки и оставляли в термостате при 37 ° С.

     Каждый  пассаж  контролировали на наличие ротавируса  методом ЭМ на микроскопе  УМВ-100К  при инструментальном увеличении  65000-85000. 

     Выделение РНК. РНК ротавирусов и реовирусов  выделяли, как описано в [3] с незначительными  авторскими  модификациями.

     Электрофорез.  Вертикальный электрофорез проводили в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) (ph-8,8)  с  концентрирующим  4% гелем (ph-5,8) при токе 8-15 мА в течение 15-24 часов.

     Диагностикумы. Для детекции  ротавирусов группы А, кроме ЭМ, использовали разработанный нами ранее антительный  эритроцитарный  диагностикум  «Ротатест» для реакции непрямой  гемагглютинации (РНГА) [1-2].

     Диагностикум  представляет собой  1% взвесь  фиксированных  эритроцитов барана, сенсибилизированных  γ- глобулиновой фракцией асцитной жидкости белых крыс, иммунизированных ротавирусом обезьян SA-11.

     Диагностикум  «Ротатест-К» получен  по указанной  выше  технологии,  но  для иммунизации крыс брали соответственно ротавирусы группы К.

     Животные. Использовали белых беспородных крыс  весом 120-150 гр. Для получения штаммоспецифических антител каждую группу крыс иммунизировали «своим» штаммом ротавируса. После 8-ой иммунизации  животным  вводили  в  брюшную полость опухоль яичника  крыс (штамм ОЯ) и  через  10-15 дней собирали  иммунное сырьё  в  виде иммунной асцитной жидкости.

Результаты

      Для адаптации ротавирусов мы отбирали  пробы, в которых по  данным  ЭМ количество двухкапсидных  вирионов  ротавируса  было  максимально, так как  наличие внешнего капсида связано с инфекционностью - способностью вируса  заражать  живую клетку. Принадлежность  этих ротавирусов к  группе А была подтверждена  в   РНГА  с ''Ротатестом''.  Потребовалось  несколько ''слепых''   пассажей,  прежде чем  все взятые  в работу штаммы ротавируса стали демонстрировать  характерные признаки повреждения клеток. Начиная с 4-ого пассажа, через  48 часов наступала полная деструкция монослоя клеток. С каждым последующим заражением количество  ротавируса нарастало и через некоторое время, нам удалось довести  его урожай на уровне 10-16 пассажа  до 1·109 - 6·109 вирионов  в 1 мл  культуральной  жидкости.

     Всего было адаптировано 18 штаммов ротавируса, которые при ЭМ имели типичную для  ротавирусов  всех групп морфологию и  не  размножались без предварительной обработки  трипсином (рис. 2).

Рисунок 2. Электронномикроскопическая  фотография: культуральные  рота-вирусы человека группы К (РВК). Негативное контрастирование. Ув. 200 000. Препарат Колпакова С. А.

А поскольку  в работу  были взяты пробы фекалий, положительные в РНГА с  «Ротатестом»  на  ротавирус  группы  А, мы  нисколько и не сомневались в принадлежности  к этой  же  группе  адаптированных нами  штаммов и других методов контроля не применяли.

     Неожиданности  начались  после того, как мы  решили  дать количественную характеристику  (титры) культуральных штаммов ротавируса человека в РНГА.

Ни один из адаптированных штаммов ротавируса не реагировал с «Ротатестом»', что сначала показалось нам совершенно невозможным, так как диагностикум  прекрасно  «работал» с антигеном  ротавируса  обезьян SA-11, выявляя его в  разведении  1:4000. Однако, наличие в  этих  пробах большого количества ротавирусов при  ЭМ, могло говорить только о том, что выращенные нами на культуре клеток вирусы, не относятся  к  ротавирусам группы А.

     Принадлежность  к  одной  из остальных групп можно было бы установить в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток с помощью антисывороток, но из-за их отсутствия это пока невозможно. Оставался ещё один путь - электрофорез в ПААГ ротавирусной РНК, позволяющий по  геному оценить принадлежность изучаемого штамма  к той  или  иной антигенной  группе.

     Первый  же  ЭФ  РНК  наших  ротавирусов  показал, что  их  электрофоретип нельзя отнести ни к одной из известных на сегодняшний день группе ротавирусов.  Для  удобства обозначения  авторы  предлагают для них рабочее  название - ротавирусы группы К (РВК).  На рис.3а  представлен ЭФ РНК 3-х культуральных штаммов РВК (треки №2-4) и  4-х штаммов  ротавируса группы  А различных  электрофоретипов (треки  №5-8), выделенных  от больных  ротавирусными ГЭ, причём  в пробе  №5  обнаружены ротавирусы  сразу  2-х  форетипов. Здесь  и далее в скобках  представлены номера анализов по рабочему журналу.

     Гены РВК оказались в 1,5-2 раза  тяжелее генов ротавируса группы А, а по характеру распределения  сегментов  похожи на  ЭФ  РНК реовируса  (рис.3а,  трек №1).

Рисунок 3. Электрофореграммы РНК: а - 1- культурального  реовируса чело-века;  2-4- культуральных ротавирусов группы К; 5- 8-ротавирусов  человека  группы  А (5-№833, 6-№834, 7- №844, 8- №818).    I- 10,0 mA,  h-16 час. б- треки  1-7 как  на ''а'';  8-10- ротавирусов  группы А (5- №833, 6- №837, 7- №818). I- 11,0 mA,  h-20 час.  ''а'' и ''б'' - ПААГ- 8%. Препарат Колпакова С. А.

Однако, если ток и время проведения ЭФ увеличить, становятся видны и существенные различия (рис.3б, треки №1и  №2-4). Количество  генов, визуально  определяемых  у  РВК равно 10, но на  каждой из  почти 100 форерамм, сделанных нами, 6-ой сегмент от начала старта  всегда  окрашивался  в 1,5-2 раза интенсивнее, чем 4-ый и 5-ый, что может говорить о том, что генов всё же 11.

     Интересные результаты получены при ЭФ проб, в которых  одновременно находятся ротавирусы группы А и  РВК: на рис. №4 (трек б)  видно, что 6-ой  ген ротавируса группы А всегда идёт слитно с 8-ым геном РВК.

Рисунок 4. Электрофореграмма  РНК:  а -только РВК (№822), б - РВК вместе с ротавирусами группы А (№844);  в -только ротавирусы группы  А (№818). Первая  колонка цифр показывает номера генов РВК, а вторая - номера генов  ротавирусов группы А.    I- 11,2 mA,   h-18 час.  ПААГ- 8%. Препарат Колпакова С. А.

Это говорит о том, что молекулярные массы  этих генов  одинаковы. А  поскольку известно, что именно продукты  6-ого (капсомеры внутреннего капсида)  гена  ротавируса  группы А ответственны  за  внешний  вид вириона  при ЭМ, то это  и объясняет с одной стороны идентичность внешнего вида вирусов с таким  непохожим профилем распределения  РНК, а с другой стороны позволяет с достаточной долей вероятности  предположить, что продуктами  8-ого  гена  РВК являются белки внутреннего  капсида (групповая специфичность).

     В качестве реовирусного стандарта мы использовали РНК культурального реовируса человека, выделенного от больного гепатитом и адаптированного к росту в культуре клеток СПЭВ. На основе  этого  вируса, нами был создан антительный эритроцитарный диагностикум ''Реотест'' для   РНГА, выявляющий  все 3 серотипа реовируса, поскольку известно, что они имеют общий  группоспецифический  антиген. Проверка  в  РНГА с «Реотестом»  всех  9   штаммов РВК, взятых в  работу, как и ожидалось, несмотря на большое количество вирусных частиц -6·109 в 1мл культуральной жидкости, показала отрицательный результат. Таким образом, ещё одним методом подтверждена уникальность и самостоятельность новой группы ротавирусов. Именно группы, так как  в перекрёстной РН на культуре клеток с моновалентными антисыворотками к  каждому штамму  ротавируса было определено  не менее трёх серотипов РВК. При этом  все  выделенные ротавирусы  имели  общий группоспецифический  антиген, так как  агглютинация с каждым  штаммом РВК сенсибилизированных  эритроцитов нового диагностикума, о котором сказано ниже, в равной мере подавлялась гомологичными и гетерологичными антителами.

     Для изучения роли РВК в детской кишечной патологии был создан с  использова-нием смеси антисывороток ко всем штаммам РВК  поливалентный  диагностикум, получивший  рабочее название «Ротатест- К».

     Диагностикум  показал  100% специфичность, реагируя  в высоких титрах только с РВК  и не  реагируя с ротавирусами  группы А, реовирусами, аденовирусами  и энтеровирусами. С его помощью  исследовали  в  РНГА  235 фекальных суспензий от детей,  больных  инфекционными ГЭ. Одновременно в этих же суспензиях искали с помощью ''Ротатеста''  ротавирусы   группы А.

     Полученные результаты оказались чрезвычайно неожиданными и интересными.                                                     

Более 75% проб оказались положительными на РВК, причём в 50 % из них выявлялись также и ротавирусы группы А. Реакция  на  РВК во всех случаях была специфичной, так  как агглютинация эритроцитов подавлялась антителами против РВК.  Наличие ротавирусов в пробах во всех случаях было  подтверждено  методом  ЭМ.

 В отличие от ротавирусов группы А, частота выделения РВК от больных инфекционными ГЭ не связана с сезонностью и  в процентном отношении равномерно распределена в течение всего года.                                          

Обсуждение

     Проведённая работа позволила не только выделить и адаптировать к росту в перевиваемой  культуре  клеток неизвестную  ранее группу ротавирусов человека, но  и показать их чрезвычайно высокую  распространённость у детей до 2-х лет  жизни с  кишечной патологией. Применение  нового эритроцитарного диагностикума при обследовании  детей, больных  инфекционными Г Э, выявило у 75 %  всех обследованных ротавирусы  новой группы, что в  100% случаев  было  подтверждено  методами  прямой просвечивающей ЭМ  и  ЭФ  РНК  РВК, выделенных  из фекальных суспензий больных.

     Полученные  предварительные  результаты, на  наш взгляд,  чрезвычайно интересны  и требуют  дополнительных исследований  в этом  направлении.

Список литературы

  1. Дроздов С. Г. и др. Ротавирусная  инфекция.  М.1989, 32 с.
  2. Колпаков С. А.  Автореф. дис. …кан-та  мед. наук. - М.,1990. 141 с.
  3. Новикова Н. А., Анцупова А. С. // Вопр. вирусол. 1987. № 2. С. 238-241.
  4. Almeida, J. D.  // J. Gen. Virol. 1978. 40, 213-219.            
  5. Brandt, C. D. et al. // J.Сlin. Microbiol. 1983. 18, 71-78.              
  6. Davidson, G. P., et al. // Lancet 1975. i: 242-245.
  7. Kalica, A. R. et al. //  Virology1978. 87, 247-255.
  8. Geyer, A., et al. //. J.S.Afr. Vet. Assoc. 1996.  67 (3), 115-116. 

Spisok literature

  1. Drozdov S. G. i dr. Rotavirusnaya  infekciya.  M.1989, 32 p.
  2. Kolpakov S. A.  Avtoref. dis. …kan-ta  med. nauk. - M.,1990. 141 p.
  3. Novikova N. A., Ancupova A. S. // Vopr. virusol. 1987. № 2. P. 238-241.
  4. Almeida, J. D.  // J. Gen. Virol. 1978. 40, 213-219.            
  5. Brandt, C. D. et al. // J.Slin. Microbiol. 1983. 18, 71-78.             
  6. Davidson, G. P., et al. // Lancet 1975. i: 242-245.
  7. Kalica, A. R. et al. //  Virology1978. 87, 247-255.
  8. Geyer, A., et al. //. J.S.Afr. Vet. Assoc. 1996.  67 (3), 115-116. 

Библиографическая ссылка

Колпаков С. А., Колпакова Е. П., Новая группа ротавирусов человека семейства Reoviridae // «Живые и биокосные системы». – 2014. – № 10; URL: http://jbks.ru/archive/issue-10/article-6