Введение

Наследственная изменчивость зависит как от характеристик физических и биологических факторов, воздействующих на генетический материал, так и от свойств тех или иных участков генома, на которые эти факторы воздействуют. Наиболее существенные для организма последствия мутационного процесса наблюдаются в том случае, когда нарушение затрагивает кодирующие участки генома, составляющие у эукариот незначительную часть ядерной ДНК, располагаясь в основном в эухроматических участках хромосом (Schofer and Weipoltshammer 2008). У подавляющего числа эукариот соотношение эухроматиновых и гетерохроматиновых районов хромосом остается неизменным на протяжении всего онтогенеза, но у немногих эукариотических организмов вследствие процесса диминуции хроматина (ДХ) изменяется структура генома в результате удаления из хромосом клеток соматической линии значительной части гетерохроматина в виде отдельных хромосом или их фрагментов (Гришанин и соавт., 2006). Диминуция хроматина (ДХ) обнаружена у некоторых пресноводных ракообразных и характеризуется вырезанием из преддиминуционных хромосом гетерохроматиновых сегментов и сшиванием эухроматических остатков с восстановлением целостности хромосом и их диплоидного числа (Гришанин и соавт., 1996).  Химический хромосомный мутагенез у видов, в онтогенезе которых происходит ДХ, до сих пор не был исследован. В качестве мутагена мы выбрали этопозид. Этопозид — производное эпидофиллотоксина, обладает противоопухолевой активностью, индуцируя апоптоз в злокачественных клетках (Fournel et al., 1995). Механизм действия этопозида состоит в стабилизации разрезов двунетевой ДНК внутри ковалентных комплексов топоизомеразы II (topo II) с ДНК, предотвращая соединение разорвавшихся концов ДНК (Wang, 1985). Исследования на лимфоцитах человека показали, что этопозид формирует также однонитевые разрывы ДНК, что приводит к нарушению процессов репликации, транскрипции и репарации (Тронов и соавт., 1999).

 Учитывая особенности действия этопозида на живые объекты, мы предположили, что при его воздействии  на эмбрионы Cyclops kolensis Lilljeborg 1901 во время додиминуционных делени дробления может наблюдаться эффект ингибирования ферментов, восстанавливающих целостность хромосом после вырезания из них фрагментов элиминируемой ДНК и, как следствие, появление в клетке отдельных фрагментов хромосом, число которых значительно превысит диплоидное число хромосом. Нас также интересовали частоты индуцируемых этопозидом АХ в клетках зародышей Cyclops kolensis до и после ДХ, и Cyclops insignis Claus, 1857, у которого диминуция хроматина не обнаружена (Grishanin et al. 2004) Для проверки этого предположения в настоящем исследовании была поставлена задача — сравнить мутагенное действие этопозида на вид циклопа, обладающего ДХ в онтогенезе - Cyclops kolensis, и на вид циклопа, у которого диминуция хроматина не обнаружена - Cyclops insignis.  

Материал и методы исследования

Для исследования действия этопозида на клетки циклопов были использованы зародыши  Cyclops kolensis Lilljeborg, 1901 и Cyclops insignis Claus, 1857, выловленные в апреле 2012-2013 г.г. в Марьинском пруду на Воробьевых горах в г. Москва. Стадии дробления зародышей вышеуказанных циклопов определяли in vivo при помощи светового микроскопа по разработанной ранее методике (Гришанин и соавт. 1996). Зародышей помещали в растворы этопозида заданной концентрации, приготовленные на основе отфильтрованной прудовой воды. Выход аберраций хромосом (АХ) определяли ана-телофазным методом, фиксируя мосты и фрагменты хромосом. Метафазный метод для изучения хромосомного мутагенеза у зародышей циклопов сильно затруднен вследствие плохой проницаемости колхицина и колцемида через стенки яйцевого мешка и яиц. Анализ анафаз и ранних телофаз проводили на стадиях 2-3 и 5-7 делений дробления. Выбор зародышей C. kolensis вышеуказанного возраста обусловлен прохождением диминуции хроматина у этого вида во время 4-го деления дробления. Хотя у российской популяции C. insignis ДХ не наблюдается (Grishanin et al. 2004), но для корректности сравнительной оценки частоты хромосомных аберраций у видов Cyclops kolensis и Cyclops insignis, зародыши C. insignis отбирали также на стадиях 2-3 и 5-7 делений дробления. Мы были вынуждены ограничить число экспериментов с C. insignis вследствие недостаточного числа выловленных индивидуумов этого вида, обусловленного низкой плотностью популяции  C. insignis в Марьинском пруду. Репродуктивный период у обоих видов циклопов в Марьинском пруду приходится на апрель месяц. Интервал времени между экспозицией в растворе этопозида и фиксацией зародышей в смеси этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 обусловлен длительностью клеточного цикла у циклопов (Гришанин и соавт. 1996) и был равен или превышал интервалы между делениями дробления. Определение достоверности разности между полученными значениями АХ при разных концентрациях действующего агента этопозида проводили по критерию Фишера (Плохинский, 1970).

Результаты исследования и их обсуждение

Тщательные исследования клеток последиминуционных зародышей C. kolensis не обнаружили наличие в них  фрагментов хромосом. Следовательно, наше предположение о задержке этопозидом процессов сшивки участков додиминуционных хромосом C. kolensis после вырезания из них элиминируемых фрагментов не подтвердилось результатами проведенного эксперимента.

Цитогенетические исследования показали  отсутствие достоверных отличий между частотами АХ, индуцированных этопозидом в клетках зародышей C. kolensis во время последиминуционных делений дробления (Табл. 1).

Таблица 1.

Экспозиция эмбрионов Cyclops kolensis во время  5-7 деления дробления (после  ДХ).

T (мин)

N

n

AХ/кл±SE

5 мг/л

 

 

 

90

6

93

0,11±0,03

контроль

7

104

0

120

9

180

0,08±0,02

контроль

9

194

0

10 мг/л

 

 

 

60

6

140

0,06±0,02

контроль

7

160

0

90

7

129

0,11±0,03

контроль

8

144

0

120

10

199

0,08±0,02

контроль

9

170

0

180

7

176

0,08±0,02

контроль

6

154

0

20 мг/л

 

 

 

60

7

127

0,12±0,03

контроль

6

116

0

90

7

152

0,09±0,02

контроль

5

80

0

120

6

122

0,11±0,03

контроль

6

109

0

180

8

181

0,13±0,03

контроль

5

89

0

50 мг/л

 

 

 

60

6

113

0,10±0,03

контроль

5

126

0

90

7

136

0,08±0,02

контроль

7

104

0

120

8

93

0,11±0,03

контроль

8

118

0

180

7

149

0,05±0,02

контроль

6

125

0

100 мг/л

 

 

 

90

7

106

0,06±0,02

контроль

9

130

0

120

9

164

0,02±0,01

контроль

6

91

0

180

9

149

0,08±0,02

контроль

7

101

0

T − время экспозиции в растворе этопозида, N − число самок с яйцевыми мешками; n − число исследованных анафаз и телофаз, AХ/кл − число аберраций хромосом (мосты и фрагменты) на одну клетку, SE − стандартная ошибка.

Неизменный уровень выхода АХ в клетках последиминуционных зародышей C. kolensis при увеличении концентрации этопозида показывает отсутствие прямой зависимости между концентрацией этопозида в воде и частотой АХ. Можно предположить, что мутагенная активность этопозида не связана с прямым воздействием этого вещества на молекулу ДНК, а опосредована созданием определенного уровня негативных изменений внутриклеточной среды индуцирующих АХ у эмбрионов C. kolensis. При этом увеличение концентрации этопозида не изменяет результирующий эффект этих изменений.

Основным результатом данной работы мы считаем обнаружение достоверных различий (β>0,999) между частотами АХ у зародышей C. kolensis до и после ДХ при экспозиции их в растворе этопозида в концентрации 100 мкг/л (Табл.1, 2).

Таблица 2.

Экспозиция эмбрионов Cyclops kolensis во время  2-3 деления дробления (до ДХ).

T (мин)

N

n

AХ/кл±SE

100 мг/л

 

 

 

90

5

112

0,24±0,04

контроль

5

72

0

120

6

132

0,05±0,02

контроль

5

80

0

180

5

137

0,04±0,02

контроль

5

93

0

T − время экспозиции в растворе этопозида, N − число самок с яйцевыми мешками; n − число исследованных анафаз и телофаз, AХ/кл − число аберраций хромосом (мосты и фрагменты) на одну клетку, SE − стандартная ошибка.

Снижение частоты АХ в клетках зародышей C. kolensis после ДХ может быть обусловлено редукцией последовательностей ДНК, связанных с ядерным матриксом (ЯМ) C. kolensis. Известно, что в этой части генома, составляющей около 1% всего генома, формируется 50% всех хромосомных мутаций, согласно Акифьеву с соавторами (1995). Закономерно, что если в результате ДХ из  генома C. kolensis удаляется значительное число последовательностей ДНК, связанных с ЯМ, то после ДХ в эмбриональных клетках соматической линии C. kolensis должна уменьшиться частота АХ.   

Чтобы обнаружить связь между чувствительностью клеток зародышей циклопов с ДХ и без ДХ, мы провели эксперименты по действию этопозида на особи российской популяции вида C. insignis, ДХ у которого не наблюдается. Исследование зародышей C. insignis, помещенных в раствор этопозида в концентрации 100 мкг/л на тех же стадиях развития, что и зародыши вида  C. kolensis (Табл. 3), не обнаружило достоверной разницы в частоте АХ у этих видов на сходных стадиях развития.

Таблица 3.

Экспозиция эмбрионов Cyclops insignis в растворе этопозида в концентрации 100мг/л.

T (мин)

N

n

AХ/кл±SE

2-3 деления дробления

 

 

 

90

6

104

0,08±0,03

контроль

5

81

0

5-7 деления дробления

 

 

 

90

5

103

0,05±0,02

контроль

5

105

0,01

180

6

92

0,05±0,02

контроль

7

103

0

 T − время экспозиции в растворе этопозида, N − число самок с яйцевыми мешками; n − число исследованных анафаз и телофаз, AХ/кл − число аберраций хромосом (мосты и фрагменты) на одну клетку, SE − стандартная ошибка.

Следовательно, различия в чувствительности хромосом C. kolensis и C. insignis в ходе раннего эмбриогенеза не опосредованы  особенностями эмбрионального развития и чувствительности клеток циклопов к действию этопозида на ранних (2-3 деления дробления) и более поздних (5-7 деления дробления) стадиях эмбриогенеза, а  являются  следствием неравноценности до- и последиминуционного генома C. kolensis.

Проведенное исследование действия этопозида на клетки зародышей  C. kolensis следует рассматривать как первую попытку  изучения воздействия химических мутагенов на хромосомный аппарат видов обладающих ДХ. Полученные данные позволяют обратить внимание на уникальный объект для исследования свойств геномов кардинально различающихся по величине и структуре вследствие ДХ, но принадлежащих одному и тому же организму.

Литература

  1. Акифьев А.П., Худолий Г.А., Якименко А.В., Краснопевцев А.В., Хандогина Е.К. 1995. G1-процесс в лимфоцитах человека, культивируемых с ФГА, и образование радиационно-индуцированных аберраций хромосом. Генетика. Т.  31. №4. С. 485-491.
  2. Гришанин А.К., Худолий Г.А., Шайхаев З.Г.О., Бродский В.Я., Макаров В.Б., Акифьев А.П. 1996. Диминуция хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus (Copepoda, Crustacea) – уникальный пример генной инженерии в природе // Генетика. Т. 32. №4. С. 492-499.
  3. Гришанин А.К., Шеховцов А.К., Бойкова Т.В., Акифьев А.П., Жимулев И.Ф.. 2006. Проблема диминуции хроматина на рубеже ХХ и XXI веков // Цитология. Т. 48. № 5. C. 379-397.
  4. Плохинский Н.А. 1970. Биометрия. М.: Изд-во МГУ. 367 с.
  5. Тронов В.А., Коноплянников Т.А., Никольская Т.А., Константинов Е.М. 1999. Апоптоз нестимулированных лимфоцитов человека и разрывы ДНК, индуцированные ингибитором топоизомеразы и этопозидом // Биохимия. Т. 64. № 3. С. 412-420.
  6. Grishanin A.K., Akifyev A.P., Dahms H.U. 2004. Nuclear DNA and remarks on chromatin diminution of cyclopoid copepods // Zool. Studies. V. 43. № 2. P. 300-303.
  7. Fournel S., Genestier L., Rouault J.P., Lizard G., Flasher M., Assoussou O., Revillard J.P. 1995. Apoptosis without decresease of cell DNA content// FEBS Letter. V. 367. №2. P. 188-192.
  8. Schofer C., Weipoltshammer K. 2008. Gene dynamics and nuclear architecture during differentiation // Differentiation.  V. 76. № 1. P. 41-56. 
  9. Wang J.C. 1985. DNA topoisomerases // Ann Rev Biochem 54. P. 665-697.

Библиографическая ссылка

Гришанин А. К., Гришанина Г. Э., Индукция хромосомных аберраций этопозидом у Cyclops kolensis и Cyclops insignis (Copepoda, Crustacea) // «Живые и биокосные системы». – 2015. – № 12; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-12/article-5.