Влияние температурного фактора на спонтанное контактное взаимодействие лимфоцитов с гранулоцитами

Введение

 При обосновании целесообразности изучения спонтанного контактного взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами мы исходили из гипотетической возможности кооперации лимфоцитов, обладающих антигенраспознающей способностью, с гранулоцитами, прежде всего нейтрофилами, реализующими эффекторную фагоцитарную (антиген-утилизирующую) функцию, но не способных определять идентифицировать степень чужеродность антигена в соответствии со спецификой его генетически детерминированной конструкции [8].

Сама идея разработки данного метода возникла в процессе изучения антигенсвязывающих лимфоцитов при остром инфаркте миокарда [6]. В частности, был разработан способ приготовления клеточной взвеси на стекле [2], принципиальной особенностью которого стала возможность более точного учета лимфоцитов, контактирующих между собой путем посредством связывания молекулы антигена антигенспецифическими рецепторами этих клеток. Преимущество данного способа заключалось в использовании при приготовлении клеточной взвеси жидких питательных сред, предварительно нанесенных на стекло. Это создавало более оптимальные цито-физиологические условия в процессе приготовления препарата и повышало точность результирующей оценки, за счет уменьшения механического (физического) артефакта при контактировании клеточных агглютинатов (агломератов) с поверхностью стекла.

Прототипом метода определения спонтанного контактного взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами (лимфоцитарно-гранулоцитарное взаимодействие) стало исследование нами спонтанной (неспецифический тест агломерации лейкоцитов) и аллергической (специфической – с миоглобином) агломерации лейкергии в мазках крови больных инфарктом миокарда [1,5].

 Однако очевидно, что при постановке реакции лейкергии лейкоциты инкубируются в присутствии аутоплазмы крови, которая может содержать иммуно-активные биомолекулы (антигены и аутоантигены, циркулирующие иммуноглобулины, аутоантитела, интерферон, интерлейкины и др.) или комплексы биомолекул (циркулирующие иммунные комплексы, белки системы комплемента и т.д.) [8]. В связи с этим, по нашему мнению, для минимизации влияния иммуно-активных биомолекул, а также эритроцитов, затрудняющих вследствие своей многочисленности в крови возможность контактного взаимодействия тестируемых клеток, необходимо изучать спонтанное контактное взаимодействие лимфоцитов с гранулоцитами после их выделения из крови и введения in vitro в искусственную систему лимфоцит – гранулоциты.

Следует отметить, что исследования контактного взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами начали проводиться нами еще в восьмидесятых – девяностых годах ХХ века, когда на базе Киргизского НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены (впоследствии НИИ профилактики и медицинской экологии Минздрава республики Кыргызстан) были проведены серии экспериментов в данном направлении с клетками иммунной системы человека, интактных и иммунизированных животных (крыс, мышей). Изучались различные аспекты взаимодействия клеток иммунной системы, в частности, влияние на него митогенов и антигенов, ионов кальция, особенности фагоцитоза и др. Однако полученные результаты были опубликованы лишь частично [3,4], в силу потенциальной патентоспособности значительной части полученных результатов.

Цель исследования

Цель данной работы заключалась в оценке влияния условий инкубации in vitro на интенсивность спонтанного контактного взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами и обсуждении полученных результатов в контексте дальнейшего их эмпирического использования 

Материал и методы

Для исследования использовали гепаринизированную кровь 12 доноров (практически здоровых лиц). В работе применяли силиконированные пробирки и стеклянные пипетки. Их, а также жидкие питательные среды и используемые растворы, применяли  охлажденными до 4⁰ С, для предотвращения активации нейтрофилов.

Кровь осторожно наслаивали на двойной градиент фиколл-верографина с удельной плотностью 1.077 и 1.119 г/см³, затем центрифугировали при 400 g в течение 45 мин.

После центрифугирования аккуратно отбирали мононуклеарные клетки из верхнего кольца и гранулоциты – из нижнего кольца. Клетки трижды отмывали в среде 199, центрифугируя 10 мин при 200 g. Фракцию мононуклеарных клеток, для удаления моноцитов, инкубировали 1 час в бакпечатках однократного применения в среде 199 при 37⁰ С. Параллельно готовили монослой гранулоцитов на покровном стекле, помещенном в другую бакпечатку, инкубируя на нем взвесь гранулоцитов (9 х 10⁶/мл) в среде 199 в течение 1 часа при 37⁰ С. Затем с покровного стекла удаляли использованную среду 199, заменяли ее отмытыми лимфоцитами в среде 199, полученными из фракции мононуклеарных клеток (4 х 10⁶/мл), и инкубировали в течение 1 часа при различной температуре: приближенной к комнатной (20⁰ С), пониженной (4⁰ С) и повышенной (37⁰ С).

После инкубации препарат фиксировали глутаровым альдегидом, высушивали, фиксировали этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимза в течение 45 минут. В световом микроскопе под иммерсией регистрировали 100 лимфоцитов и определяли процент этих клеток с присоединившимися к их поверхности гранулоцитами.

Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Спонтанное контактное взаимодействие лимфоцитов с гранулоцитами (СКГЛ) наблюдалось при всех изучаемых температурных параметрах совместного инкубирования клеток. При этом регистрировались три различных типа этого взаимодействия: 1) СКНГЛ –взаимодействие лимфоцита с одним гранулоцитом (низко-гранулоцитофильные лимфоциты); СКСГЛ – взаимодействие лимфоцита с двумя гранулоцитами (средне-гранулоцитофильные лимфоциты); СКВГЛ – взаимодействие лимфоцита с тремя и более гранулоцитами (высоко-гранулоцитофильные лимфоциты) (Табл.1).

Таблица 1. Влияние температуры на интенсивность спонтанного контактного взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами (%)

     Примечание:  **  – статистически достоверное различие от показателя, отражающего данный тип спонтанного контактного взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами при других температурных условиях инкубации клеток.

    Наиболее интенсивное спонтанное контактное взаимодействие лимфоцитов с гранулоцитами (СКГЛ) наблюдалось при температуре 20⁰ С. Эта закономерность была присуща и для СКСГЛ. А вот другие типы контактного взаимодействие лимфоцитов с гранулоцитами (СКВГЛ) чаще регистрировались при повышенной температуре

(37⁰ С), либо (СКНГЛ) при пониженной температуре.     

    Эта закономерность свидетельствует в пользу того, что спонтанное контактное взаимодействие лимфоцитов с гранулоцитами in vitro может отражать различие в функциональных или морфофункциональных фенотипических признаках исследуемых клеток.

    При кратковременном действии высокой внешней температуры in vivo (в течение двух часов при температуре 38⁰ С) [Надеждин и др.]  наблюдается несколько иная картина. Авторы заключают, что при действии данной температуры в качестве тенденции появляется повышение адгезионных свойств нейтрофилов. Исходя из данных [7], можно думать, о том, что возрастание числа СКВГЛ в процессе инкубации изучаемых нами клеток при повышенной температуре отражает повышение адгезионных свойств нейтрофилов, возможно, и лимфоцитов.

   Известно, что к одной из общих характеристик молекул адгезии относится их способность экспрессироваться на различных типах клеток иммунной системы (субпопуляции лимфоцитов, нейтрофилы, естественные киллеры и т.д.) [9]. В частности, с цитомембраной нейтрофилов связаны молекулы адгезии β2 – интегрины (LFA-1, Mac-1, p150, 95) и L- селектин, с мембраной лимфоцитов – LFA-1 [10].

    С нашей точки зрения особенности спонтанного контактного взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами проистекают вследствии того, что: 1) исходные клетки, до их совместного инкубирования, освобождаются от плазмы крови, а следовательно и от присутствующих в плазме крови биомолекул (антигенов и аутоантигенов, антител, аутоантител, циркулирующих иммунных комплексов, комплемента и др.), которые способны прямо или косвенно влиять на контактное взаимодействие данных клеток, взаимодействуя с соответствующими рецепторами их цитомембран; 2) инкубирование взаимодействующих клеток осуществляется на достаточно большой горизонтальной поверхности подложки, а не на локально- ограниченном дне центрифужной пробирки, что позволяет высокомобильным нейтрофилам реализовывать естественный цитокин-ориентированный маршрут.

Выводы

1. Лимфоциты контактно взаимодействуют с гранулоцитами при различных температурах инкубации.
2. Спонтанное контактное взаимодействие лимфоцитов с гранулоцитами in vitro реализуется в виде трех различных типов этого взаимодействия, интенсивность проявления которых связана с температурными параметрами совместной инкубации данных клеток.

Список литературы

1. Евстропов В.М. Клеточные иммунологические реакции с миоглобином и актомиозином при инфаркте миокарда. Первый съезд кардиологов Украинской ССР: Тезисы докладов. – Киев. – 1978. – С.61.

2. Евстропов В.М. Приготовление клеточной взвеси на стекле // Лабораторное дело. – 1983. – №.2. – С 54.

3. Евстропов В.М., Сорокина Н.А. Некоторые закономерности физического антигеннезависимого взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами крови человека // Окружающая среда и здоровье человека: Труды НИИ профилактики и медицинской экологии.

4. Евстропов В.М., Степко И.Н., Сорокина Н.А. Феномен физического антигеннезависимого взаимодействия лимфоцитов с гранулоцитами // Окружающая среда и здоровье человека: Труды НИИ профилактики и медицинской экологии. – Бишкек. – 1993. – Т.1. – С.157 – 162. –  Бишкек. – 1993. – Т.1. – С. 152 – 156.

5. Китаев М.И., Евстропов В.М., Клейменов В.Н. Лимфоцитарно-гранулоцитарное взаимодействие в феномене аллергической агломерации аллергенолейкергии у больных инфарктом миокарда // Здравоохранение Киргизии. – 1986. – №.1. – С.43 – 45.

6. Миррахимов М.М. Антигенсвязывающие лимфоциты при остром инфаркте миокарда / М.М. Миррахимов, М.И. Китаев, Б.Н. Тюребаева, В.М. Евстропов // Кардиология. – 1981. – №.1. –  С.12 – 15.

7. Надеждин С.В. Изменения функциональной активности лейкоцитов в условиях острого перегревания организма / С. В. Надеждин, М. З. Федорова, Н. А. Павлов, Е. В. Зубарева. // Научные ведомости. – 2008. – №. 3. – С.5 – 11.

8. Ройт А. Основы иммунологии / Пер. с англ. Т.В.Великодворской, Т.Н.Власик, А.А.Нейфаха. – М.: Мир. 1991. –  328 с.

9. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. – СПб.: Наука, 2000. – 231 с.  

10. Ярилина А.А. Роль молекул адгезии в патогенезе ревматоидного артрита // Научно-практическая ревматология. – №. 1. – 2000. – С.61 – 69.

Spisok literaturyi

1. Evstropov V.M. Kletochnyie immunologicheskie reaktsii s mioglobinom i aktomiozinom pri infarkte miokarda. Pervyiy s'ezd kardiologov Ukrainskoy SSR: Tezisyi dokladov. – Kiev. – 1978. – S.61.

2. Evstropov V.M. Prigotovlenie kletochnoy vzvesi na stekle // Laboratornoe delo. – 1983. – #.2. – S 54.

3. Evstropov V.M., Sorokina N.A. Nekotoryie zakonomernosti fizicheskogo antigennezavisimogo vzaimodeystviya limfotsitov s granulotsitami krovi cheloveka // Okruzhayuschaya sreda i zdorove cheloveka: Trudyi NII profilaktiki i meditsinskoy ekologii.

4. Evstropov V.M., Stepko I.N., Sorokina N.A. Fenomen fizicheskogo antigennezavisimogo vzaimodeystviya limfotsitov s granulotsitami // Okruzhayuschaya sreda i zdorove cheloveka: Trudyi NII profilaktiki i meditsinskoy ekologii. – Bishkek. – 1993. – T.1. – S.157 – 162. – Bishkek. – 1993. – T.1. – S. 152 – 156.

5. Kitaev M.I., Evstropov V.M., Kleymenov V.N. Limfotsitarno-granulotsitarnoe vzaimodeystvie v fenomene allergicheskoy aglomeratsii allergenoleykergii u bolnyih infarktom miokarda // Zdravoohranenie Kirgizii. – 1986. – #.1. – S.43 – 45.

6. Mirrahimov M.M. Antigensvyazyivayuschie limfotsityi pri ostrom infarkte miokarda / M.M. Mirrahimov, M.I. Kitaev, B.N. Tyurebaeva, V.M. Evstropov // Kardiologiya. – 1981. – #.1. – S.12 – 15.

7. Nadezhdin S.V. Izmeneniya funktsionalnoy aktivnosti leykotsitov v usloviyah ostrogo peregrevaniya organizma / S. V. Nadezhdin, M. Z. Fedorova, N. A. Pavlov, E. V. Zubareva. // Nauchnyie vedomosti. – 2008. – #. 3. – S.5 – 11.

8. Royt A. Osnovyi immunologii / Per. s angl. T.V.Velikodvorskoy, T.N.Vlasik, A.A.Neyfaha. – M.: Mir. 1991. – 328 s.

9. Totolyan A.A., Freydlin I.S. Kletki immunnoy sistemyi. – SPb.: Nauka, 2000. – 231 s.

10. Yarilina A.A. Rol molekul adgezii v patogeneze revmatoidnogo artrita // Nauchno-prakticheskaya revmatologiya. –#. 1. – 2000. – S.61 – 69.