Assessment of the main parameters of catalase kinetics in soil

Введение. При исследовании механизма ферментативного катализа в энзимологии широко применяются кинетические методы – это определение скорости ферментативной реакции в зависимости от различных факторов – температуры, рн, концентрации фермента и субстрата, наличия кофакторов ингибиторов, адсорбции ферментов и т.д. [2, 3].

По вопросам кинетики ферментативных процессов почв проведены многочисленные исследования [1–4, 9, 11-14], которые позволяют утверждать о реальности применения методов классической стационарной кинетики для описания энзиматических процессов в почве и познания механизма действия почвенных ферментов.

Простейшая схема ферментативного катализа включает обратимое образование промежуточного комплекса фермента (Е) с реагирующим веществом (субстратом, S) и разрушение этого комплекса с образованием продуктов реакции (P). В простейшем случае уравнение реакции с участием фермента имеет вид [6, 8]:

(1)

где Е – фермент; S – субстрат; [ES] – фермент-субстратный комплекс (так называемый комплекс Михаэлиса); P – продукт; k₊₁ – константа скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса из фермента и субстрата; k_-1 – константа скорости реакции диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и субстрат; k₂ – константа скорости реакции превращения фермент-субстратного комплекса в фермент и продукт.

Выражение для начальной скорости (?₀) реакции выглядеть так [6-9]:

(2)

где [S]₀ – начальная концентрация субстрата, V_max – максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом и K_M=( k_-1+ k₂)/ k₊₁ – называется константой Михаэлиса теории Бриггса – Холдейна.

Уравнение (2) является фундаментальным уравнением ферментативной кинетики и обычно называется уравнением Михаэлиса – Ментен или Бриггса–Холдейна. Оно служит полезной отправной точкой для анализа кинетики ферментативных процессов.

Известно, что со временем скорость реакции v=d[P]/dt уменьшается, так как уменьшается накопление продукта. Уменьшение скорости может объясняться следующими причинами:

• поскольку в ходе реакции концентрация субстрата уменьшается, то уменьшается и степень насыщения фермента субстратом;
• продукты реакции могуть угнетать активность фермента;
• при увеличении концентрации продуктов реакция равновесия может сдвигаться влево;
• возможна инактивация фермента или кофермента из-за нестабильности условий, при которых проводится опыт;
• все перечисленные факторы могут действовать одновременно.

Для того чтобы избежать влияния этих факторов на кинетику ферментативных реакций, стараются оперировать не скоростью реакции вообще, а скоростью реакции в начальной момент времени (t=0, т.е. начальной скоростью υ₀). В этот начальной период времени всевозможные нежелательные факторы еще не успевают проявить свое действие

Одной из основных задач ферментативной кинетики является нахождение значения начальной скорости υ₀ от времени. Эта задача решается в основном аналитическим методом.

Аналитический метод определения начальной скорости ферментативных реакций основан на установлении наиболее истинного (адекватно описывающего) аналитического выражения кинетической кривой υ=P(t). Для этого можно воспользоваться полиномом степени n по t:

                                                                                                                                 (3) 

Коэффициенты a_i находятся с применением математических пакетов. Величину [P(t)] измеряют через определенные промежутки времени t.

Следовательно, если имеется аналитическое уравнение для кинетической кривой υ=P(t), то с помощью формулы  можно определить начальную скорость υ₀. Для выражения (3) она имеет вид:

(4)

В принципе, чем больше членов содержит модель (3), тем лучше можно описать кинетическую кривую.

Метод определения  с помощью (4) обладает своими достоинствами и недостатками. С одной стороны, этот метод можно применять независимо от того, известно ли истинное уравнение скорости реакции; метод пригоден и в тех случаях, когда процесс осложняется во времени денатурацией фермента.

С другой стороны, использование (4) дает гораздо меньше информации о кинетической кривой. Коэффициенты a₀, a₁, a₂,....- не имеют физического смысла, и их нельзя преобразовать в параметры, связанные с механизмом ферментативного процесса [6].

После определения значения начальной скорости υ₀, далее на основе формулы (2), легко можно найти кинетические параметры V_max , K_M и V_max/K_M.

Показателем экологического состояния почв и ее биологической активности является наличие и активность каталазы (Н₂О₂:Н₂О₂), которая характеризует потенциальную способность экосистемы сохранять гомеостаз.

Роль каталазы в почве заключается в том, что она разрушает ядовитую для организмов перекись водорода [5, 7, 12].

Активность каталазы в почве в большей степени зависит от воздушного режима, гранулометрического состава почв, окислительно-восстановительного потенциала и других условий [10]. Изменение свойств почв на фоне освоения оказывает влияние и на активность каталазы. При сельскохозяйственном освоении возможно нарушение работы ферментных комплексов, поэтому изучение активности каталазы в почвах является актуальным.

Вопросы изменения кинетических характеристик каталазы в почвах Турции на основе использования начальной скорости до настоящего времени оставались неизученными.

Целью наших исследований являлось повысить точность определения начальной скорости и кинетических параметров изучения кинетических характеристик каталазы (V₀, Км , Vмах , Vмах / Км ) в почвах района Чумры (Провинция Конья, Турция). Эти параметры являются важной характеристикой почвенной биологической активности и почвенного плодородия.

Условия, материалы и методы исследования. Район исследования Чумра (Çumra) расположен в Центральной Анатолии, в провинции Конья, в центральной части Турции между 37–38⁰ восточной долготы и 33–34⁰ северной широты на высоте 1013 м н.у.м.

Климатические условия района Чумры и его окружения формируются под воздействием различных географических факторов, из которых самым главным является континентальность: лето жаркое и сухое, а зима холодная и малоснежная. Средняя годовая температура составляет около 11⁰С, а среднегодовая сумма осадков 324 мм. Количество осадков заметно снизилось в последние годы по сравнению с предыдущими годами исследований.

На опытном участке сельскохозяйственного факультета университета Сельджук (г. Конья) был заложен почвенный разрез. Опытный участок (с выращиваемой традиционной для района сахарной свеклой) орошался капельным способом полива.

Почвенные образцы были отобраны в слое 0–30 см. Физико-химическая характеристика исследованных образцов представлена в таблице 1. Почва опытного участка имеет тяжелый гранулометрический состав по всему профилю. По международной классификации почва являетя аллювиальной карбонатной тяжелосуглинистой.

Таблица. 1. Физико-химическая характеристика почвы (0–30 см)

*SC – Silty Clay (Средняя легкая тяжелая глина)

Для определения активности каталазы использовали газометрический метод в модификации Галстяна [5,12].

Результаты исследования. Активность каталазы определяли при постоянном помешивании в воздушно-сухих почвенных образцах, используя свежеприготовленные субстраты различной концентрации (3, 6, 9, 18 и 24 %). Фиксировали количество выделяющегося кислорода за 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 и 5 мин. (Таблица 2 и рисунок 1).

Скорость разложения пероксида водорода каталазой в почвах выражали по объему выделившегося кислорода в мл ([P]=O₂) за t=0.5, 1.0,..., 4.5 и 5 мин на 1 г сухой почвы. Опыт проводили при температуре 18–20 °С .

Таблица 2. Количество выделившегося кислорода [P], в мл O₂ на 1 г почвы

Рис 1. Изменение объема выделившегося кислорода в мл ([P]=O₂) на 1 г почвы.

Используя экспериментальные данные (Таблица 2), для полиномов 4, 5, 6 и 7 степени, с применением математического пакета Statistica 12, для каждой концентрации (3, 6, 9, 12, 18 и 24 %) субстрата, были вычислены коэффициенты модели (3).

Потом, используя эначения этих коэффициентов, с помощью формулы (4) вычислили значения начальной скорости фермента каталазы (Таблица 3) и основные статистические параметры, показывающие адекватность моделей (3) (Таблица 4).

Таблица 3. Значение начальной скорости v₀ (мл O₂ / минута на 1 г почвы)

Таблица 4. Основные статистические параметры моделей (3) для 4, 5, 6 и 7.

Здесь, ESS – остаточная сумма квадратов, характеризующая отклонение от регрессии, R²_adj – скорректированный коэффициент детерминации, RMSE – средняя квадратичная ошибка модели, A – относительная ошибка аппроксимации, AICc – информационный критерий Акаике, F, F(α= 0,05) и F(α= 0,01) – соответственно вычисленные и табличные значении критерия Фишера.

Анализируя статистические показатели всех рассмотренных моделей, приведенные в таблице 4, установили, что зависимость между [P] и t лучше всего описывается полиномом 4-той степени.

Далее, для определения параметров V_мах и К_м модели (2), использовали найденные значения начальной скорости (Таблица 3). Для всех рассмотренных степеней полинома (3), с помощью программы Statistica 12, вычислили значения этих кинетических параметров и их статистические показатели (Таблица 5).

Таблица 5. Основные статистические параметры моделей (2).

Анализируя статистических (Standard Error, t-value for df = 5, p-level, Lo. Conf и Up. Conf Limit) показателей параметров V_мах и К_м модели (2), еще раз показывает, что результаты нами проведенных анализов лучше описывается полиномом 4-той степени.

Окончательные значение кинетических параметров V_мах , К_м и V_мах / К_м, вычисленные с помощью значений начальных скорости, определенные по полиному 4-степени и имеют следующие значения: V_мах= 44,5896 мл О2/мин на 1 г почвы, К_м =11,9193 % и V_мах / К_м=3,7409.

Выводы

Проведенные исследования показывают зависимость накопления продуктов ферментативной реакции для каталазы от продолжительности инкубации при различных концентрациях субстратов в почвах провинции Коньи: количество продуктов реакции растет нелинейно, более того описывается наиболее точной и адекватной моделью – полиномом 4 степени. С использованием этой модели были вычислены значения начальной скорости для каждой концентрации субстрата. Кривые зависимости начальной скорости каталазной реакции в почве от концентрации субстрата для почв района Чумра имеют монотонную форму. Таким образом, нам удалось повысить точность определения начальной скорости реакции и кинетических параметров V_max и K_M ферментативной реакции разложения перекиси водорода каталазой в реальных почвенных условиях.

Список литературы

1. Алиев С. А., Гаджиев Д. А., Микайылов Ф. Д. Кинетические показатели активности каталазы в основных типах почв Азербайджанской ССР // Почвоведение, 1981. №9. С. 107–112.

2. Алиев С. А., Гаджиев Д. А., Микайылов Ф. Д. Кинетические и термодинамические характеристики ферментов инвертазы и уреазы в почвах Азербайджанской ССР // Почвоведение, 1984. №11. С. 55–66.

3. Асеева И.В., Паников Н.С. Кинетика ферментативных процесов распада нуклеиновых кислот в почве // Экологические условия и ферментативная активность почв.Уфа, 1979. С. 112–125.

4. Водопьянов В.В., Гузаиров М.Б., Киреева H.A. Математическое моделирование процессов в антропогенно нарушенных почвенных биосистемах. М.: Машиностроение, 2010. 232 с.

5. Галстян А. Ш. Унификация методов определения активности ферментов почв // Почвоведение, 1978. №2. С. 107–114.

6. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1979. 280 с.

7. Купревич В. Ф., Щербакова Т. А. Почвенная энзимология. Минск: Наука и техника, 1966. 275 с.

8. Курский М. Д., Костерин С.А., Рыбальченко В. К. Биохимическая кинетика. Киев: Высшая школа, 1977. 262 с.

9. Микайылoв Ф.Д., Хабиров И.К. Некоторые вопросы моделирования ферментативных процессов в почве // Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно-преобразованных экосистем: Материалы III Международной научно-практической конференции Иркутск (Россия), 2011, 15–22 августа. С.166–171.

10. Раскова Н.В., Звягинцев Д.Г. Активность каталазы в почвах под широколиственно-еловым лесом и лугом // Почвоведение, 1981. №6. С. 76–81.

11. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. М.: Наука, 1983. 203 с.

12. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 2005. 254 с.

13. K?z?lkaya R, Samofalova I, Mudrykh N, Mikailsoy F, Akça ?, Sushkova S, MinkinaT. Assessing the impact of azadirachtin application to soil on urease activity and its kinetic parameters. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 2015. 39(6). Рp. 976 – 983.

14. Mikayilov F.D., Erol A.S., Ag?rcan B., Temel K.A. Mathemat?cal model?ng of catalase act?v?ty ?n so?ls // Proceedings of the International Conference on ‘Prospects of Innovative Development of Agriculture’, (11 – 14 march, 2014, Ufa, Russia). Гафб 2014. Part 1. Рp. 182 – 190.