Введение 

Доминирующая роль ядра в растительной клетке неопровержимо доказана многочисленными генетическими исследованиями. Однако в пластидах и митохондриях растительных клеток локализованы еще и собственные генетические системы [10]. Эти системы функционируют различно, но взаимосвязано. Примером взаимодействия нескольких генетических систем у растений является процесс фотосинтеза, в котором участвуют белки, кодируемые как ядерной, так и хлоропластной ДНК (хлДНК) [3]. В связи с этим хлорофильные мутанты являются удобной генетической моделью для изучения механизмов биогенеза фотосинтетического аппарата и ядерно-пластидных взаимодействий. Большинство такого рода исследований проводят на жизнеспособных мутантах типа chlorina с желто-зеленой окраской листьев [2, 4, 9]. Хлорофильные мутации представлены двумя типами – ядерные и пластомные (внеядерные). Подавляющее число работ посвящено хлорофильным мутациям ядерного типа, в то время как пластомные мутации менее изучены [5, 7].  В предыдущей работе [1] мы привели результаты морфофизиологического, гибридизационного и ультраструктурного анализов внеядерных мутантов типа chlorina. Целью данного исследования является сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК и особенностей фотохимической активности фотосистем I (ФС I) и II (ФС II) у хлорофилл-дефицитных мутантов подсолнечника с внеядерным типом наследования.

 
Материал и методы исследования

Объектами исследования служили растения подсолнечника (Helianthus annuus L.) линии 3629 и мутантных линий en:chlorina-1, en:chlorina-6, en:chlorina-7. Все анализируемые мутанты с желто-зеленой окраской листьев были получены на генетической основе одной инбредной линии 3629 с помощью индуцированного нитрозометилмочевиной мутагенеза [11] и имеют внеядерный тип наследования мутаций [1]. Мутантные линии характеризуются сниженным содержанием хлорофиллов (a+b) приблизительно на 30 % по сравнению с исходной линией 3629 [1].

Выделение ДНК из гомогенатов листьев подсолнечника проводили с помощью коммерческого набора «Сорб-ГМО-Б» (Синтол, Россия). Библиотеки для высокопроизводительного секвенирования были приготовлены с использованием набора реактивов Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina, США). Определение полных последовательностей геномов осуществлялось методом высокопроизводительного параллельного секвенирования с применением прибора MiSeq (Illumina, США) и набора реактивов MiSeq Reagent Kit v2 500-cycles (Illumina, США). Качество полученных ридов оценивали с помощью программы FastQC. Используя программу Trimmomatic проводили тримминг ридов, содержащих адаптерную последовательность или имеющих качество прочтения (Q-score) ниже 25. На основе полученных парных ридов проводили de novo сборку (ассемблер SPAdes v 3.10.1) хлоропластных геномов и путем их выравнивания (BLAST) относительно хлДНК линии 3629 осуществляли поиск полиморфных сайтов в хлДНК мутантных линий.

Параметры, характеризующие фотохимическую активность ФС I и ФС II, рассчитывали с использованием метода индукции флуоресценции Хл для листьев подсолнечника, адаптированных в течение 30 минут к темноте. К ним относились: показатель эффективности функционирования электронтранспортной цепи (ETR), константы фотохимического (qP) и нефотохимического тушения (qN, NPQ) флуоресценции, максимальный квантовый выход фотохимических реакций ФС II (Fv/Fm), эффективные квантовые выходы фотохимических реакций ФС I и ФС II (Y(I) и Y(II)), квантовый выход регулируемой (Y (NPQ)) и нерегулируемой (Y (NO)) диссипации энергии в ФС II, а также квантовые выходы фотохимических реакций ФС I, характеризующие донорные (Y (ND)) и акцепторные (Y (NA)) свойства Р700. Определение параметров индукции флуоресценции Хл проводили на PAM-флуориметре «DUAL-PAM 100» (HeinzWalz, Германия) с модулем регистрации флуоресценции P700 согласно Kramer et al. [8]. Все данные представлены как средние арифметические и их стандартные отклонения, вычисленные из трех независимых опытов. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p = 0,05.

 

Результаты исследования и их обсуждение 

В результате молекулярно-генетического анализа хлоропластных геномов у хлорофилл-дефицитных линий подсолнечника всего выявлено 14 полиморфных сайтов: два в хлДНК линии en:chlorina-1, пять – в en:chlorina-6 и семь – в en:chlorina-7 (таблица 1).

 

Таблица 1Локализация мутаций в хлоропластных геномах линий en:chlorina-1, en:chlorina-6, en:chlorina-7

 

Позиция в хлоропластном геноме 3629

Линия 3629

en:chl-1

en:chl-6

en:chl-7

Локализация мутации

Тип мутации

13467

C

C

C

T

rpoB

Несинонимичная Ser138Leu

37493

G

A

G

G

psaB

Несинонимичная

Thr586Ile

38096

C

C

T

C

psaB

НесинонимичнаяGly385Glu

39945

G

G

G

A

psaA

Несинонимичная

Thr528Ile

69191

C

C

С

T

МГР* rps12-clpP 

 

72247

C

C

С

T

psbB

Несинонимичная

His157Tyr

74767

G

G

A

G

интрон petB 

 

77386

G

G

G

A

rpoA

Синонимичная 

78641

C

C

C

T

rps11 

Синонимичная 

82325

G

G

A

G

rps3

Синонимичная 

110809

G

G

G

A

ycf1 

Синонимичная 

115094

C

C

T

C

ndhA

НесинонимичнаяAla141Val 

116823

C

C

T

C

ndhA

Несинонимичная

Thr356Ile 

119680

C

T

C

C

ndhD

Синонимичная 

*МГР – межгенный регион

 

Две мутации из четырнадцати были выявлены в некодирующих областях хлДНК: SNP в позиции 72247 хлДНК линии en:chlorina-7 локализован между генами rps12 и clpP, SNP в позиции 74767 хлДНК линии en:chlorina-6 – в интроне гена petB. Двенадцать SNP было обнаружено в кодирующих последовательностях хлДНК. Мутации в генах rpoA, rps11, ycf1, rps3, ndhD оказались синонимичными, в то время как мутации в генах rpoB (Ser138Leu), psaA (Thr528Ile), psbB (His157Tyr), psaB (Thr586Ile и Gly385Glu), ndhA (Ala141Val), ndhA (Thr356Ile) приводят к замене аминокислот транслируемых белков.

Хлоропластные гены весьма консервативны [6], поэтому мы предположили, что мутантный фенотип исследуемых линий подсолнечника связан с несинонимичными мутациями. Мы провели поиск в базе данных NCBI нуклеотидных последовательностей, гомологичных мутантным аллельным вариантам генов, и установили, что SNP в генах rpoB (Ser138Leu) и ndhA (Ala141Val, Thr356Ile) являются распространенными полиморфными сайтами в хлДНК растений с нормальным фенотипом. Следовательно, эти замены, скорее всего, не связаны с мутантным, желто-зеленым, фенотипом у растений подсолнечника. Гораздо больший интерес представляют мутации в генах psaA, psaB и psbB, кодирующих белки, входящие в состав реакционных центров ФС I (psaA, psaB) и ФС II (psbB). Эти белки являются необходимыми компонентами для функционирования фотосистем, и изменения в их структуре могут влиять на активность фотосистем и содержание хлорофиллов.

Показатели фотохимической активности ФС I и ФС II хлорофилл-дефицитных мутантов подсолнечника представлены в таблице 2.

 

Таблица 2 – Сравнительные значения параметров, характеризующих активность ФС I и II, линий  3629, en:chlorina-1, en:chlorina-6, en:chlorina-7

 

Параметры

Линия 3629

en:chlorina-1

en:chlorina-6

en:chlorina-7

Fo

0,98±0.07

1,66±0.04

1,45±0.14

1,18±0,01

Fm

4,33±0.25

5,35±0.14

5,12±0.14

3,81±0,14

Fv/Fm

0,77±0.03

0,69±0.01

0,72±0.04

0,72±0,00

Y(II)

0,64±0.05

0,41±0.02

0,42±0.05

0,64±0,02

ETR(II)

35,13±2.83

22,75±0.90

23,10±2.97

32,33±1,13

qP

0,87±0.03

0,69±0.01

0,68±0.03

0,87±0,02

qN

0,22±0.03

0,43±0.02

0,46±0.04

0,20±0,00

NPQ

0,23±0.04

0,52±0.03

0,59±0.07

0,20±0,00

Y(NPQ)

0,07±0.02

0,20±0.01

0,22±0.04

0,08±0,00

Y(NO)

0,29±0.04

0,39±0.01

0,36±0.02

0,27±0,01

Pm

1,76±0.11

1,16±0.13

1,48±0.02

1,13±0,15

Y(I)

0,77±0.08

0,80±0.02

0,76±0.01

0,86±0,00

ETR(I)

42,20±4.50

43,98±1.11

41,55±0.35

47,17±0,21

Y(ND)

0,15±0.06

0,13±0.02

0,12±0.04

0,22±0,01

Y(NA)

0,08±0.04

0,07±0.01

0,12±0.05

0,04±0,00

 

Среди исследуемых нами параметров фотохимической активности ФС I, прежде всего, следует отметить значительное снижение максимального уровня флуоресценции (Pm): на 35 % у en:chlorina-1 и en:chlorina-7 и на 15 % у en:chlorina-6. Изменение такого параметра, как Pm, свидетельствует о редукции комплексов ФС I и предположительно связано с мутациями в генах psaAen:chlorina-7) и psaB en:chlorina-1, en:chlorina-6). Значения квантового выхода (Y(I)) и эффективности транспорта электронов (ETR(I)) ФС I у мутантов en:chlorina-1, en:chlorina-6 не отличались от линии 3629, а у растений en:chlorina-7 – были на 10 % выше.

Также были зарегистрированы достоверные изменения параметров фотохимической активности ФС II. У мутанта en:chlorina-7 отмечены снижение на 7—10 % нескольких показателей активности ФС II, а именно: максимального уровня флуоресценции (Fm), максимального квантового выхода фотохимических реакций (Fv/Fm), эффективного квантового выхода (Y(II)) и эффективности транспорта электронов (ETR(II)). Данные изменения могут быть ассоциированы с мутацией в гене psbB. Значительное снижение (на 35 %) Y(II) и ETR(II) также обнаружено у мутантов en:chlorina-1, en:chlorina-6. Интересно, что по сравнению с линией 3629 у en:chlorina-1, en:chlorina-6 в два раза увеличено значения нефотохимического тушения флуоресценции (qN), при этом регулируемая диссипация (Y(NPQ)) увеличена в три раза, а нерегулируемая диссипация (Y(NО)) – в 1,3 раза. Подобных изменений не выявлено у мутанта en:chlorina-7.

 

Заключение 

Таким образом, в результате проведенного сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей хлоропластных геномов исходной линии 3629 и мутантных хлорофилл-дефицитных линий en:chlorina-1, en:chlorina-6, en:chlorina-7 с внеядерным типом наследования было обнаружено 14 SNP, 12 из которых были локализованы в генах, а остальные 2 – в некодирующих последовательностях ДНК. При этом 7 мутаций, локализованных в генах rpoB, psaA, psbB, psaB, ndhA, являются несинонимичными. Также были получены данные, позволяющие оценить фотохимическую активность фотосистем I и II. Сравнительный анализ локализованных в хлоропластной ДНК мутаций и фотохимической активности позволяет предположить, что мутантный фенотип en:chlorina-1 непосредственно связан с несинонимичной мутацией в гене psaB (Thr586Ile), en:chlorina-6 – в гене psaB (Gly385Glu), а en:chlorina-7 – в генах psaA (Thr528Ile) и psbB (His157Tyr).

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №18-34-00659.

Список литературы

1.  Усатов А. В., Колоколова Н. С., Усатова О. А., Рожкова О. К., Чеснокова Н. А., Федорова М. А., Усатов Н. А., Плотников В. Г. Хлорофильные мутации подсолнечника, индуцированные N-нитрозо-N-метилмочевиной и особенности их наследования II. Внеядерные мутации en:chlorina // «Живые и биокосные системы», 2013.  № 3; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-3/article-20

2.  Ansari M. J., Al-Ghamdi A., Kumar R. et al. Characterization and gene mapping of a chlorophyll-deficient mutant clm1 of Triticum monococcum L. // Biologia plantarum, 2013. Vol. 57. – Pp. 442—448.

3.  Bock R. Cell and Molecular Biology of Plastids // Heidelberg, Germany: Springer-Verlag, 2007. – 534 p.

4.  Brestic M., Zivcak M., Kunderlikova K.  et al. Low PSI content limits the photoprotection of PSI and PSII in early growth stages of chlorophyll b-deficient wheat mutant lines // Photosynthesis research, 2015. Vol. 125. – Pp. 151—166.

5.  Colombo N., Emanuel C., Lainez V. et al.  The barley plastome mutant CL2 affects expression of nuclear and chloroplast housekeeping genes in a cell-age dependent manner  // Molecular Genetics and Genomics, 2008.  Vol. 279. – Pp. 403—414.

6.  Drouin G., Daoud H., Xia J. Relative rates of synonymous substitutions in the mitochondrial, chloroplast and nuclear genomes of seed plants // Molecular Phylogenetics and Evolution, 2008.  Vol. 49.  № 3. – Pр. 827—831.

7.  Hirao T., Watanabe A., Kurita M. et al. A frameshift mutation of the chloroplast matK coding region is associated with chlorophyll deficiency in the Cryptomeria japonica virescent mutant Wogon-Sugi // Current genetics, 2009. Vol. 55. – Pp. 311—321.

8.  Kramer D. M, Johnson G., Kiirats O., Edwards G.E., 2004. New fluorescence parameters for the determination of QA redox state and excitation energy fluxes // Photosynthesis Res., 2004. Vol. 79. – Pp. 209—218.

9.  Li N., Jia J., Xia C.  et al. Characterization and mapping of novel chlorophyll deficient mutant genes in durum wheat  // Breeding Science, 2013. Vol. 63. – Pp. 169—175.

10. Stanley L., Forrester N. J., Govindarajulu R., Liston A., Ashman T. L.  Geographic patterns of genetic variation in three genomes of North American diploid strawberries with special reference to Fragaria vesca subsp. Bracteata // Botany, 2015.  Vol. 93.  № 9. – Pp. 573—588.

11. Usatov A.V., Razoriteleva E. K., Mashkina E. V., Ulitcheva I. I. Spontaneous and Nitrosomethylurea-Induced Reversions in Plastome Chlorophyll Mutants of Sunflower Helianthus annuus L. // Russian Journal of Genetics, 2004.  Vol.40. №2. – Pp. 186—192.

Spisok literatury 

1.  Usatov A. V., Kolokolova N. S., Usatova O. A., Rozhkova O. K., Chesnokova N. A., Fedorova M. A., Usatov N. A., Plotnikov V. G. Xlorofil'nye mutacii podsolnechnika, inducirovannye N-nitrozo-N-metilmochevinoj i osobennosti ix nasledovaniya II. Vneyadernye mutacii en:chlorina // «Zhivye i biokosnye sistemy», 2013. № 3; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-3/article-20

2.  Ansari M. J., Al-Ghamdi A., Kumar R. et al. Characterization and gene mapping of a chlorophyll-deficient mutant clm1 of Triticum monococcum L. // Biologia plantarum, 2013. Vol. 57. – pp. 442-448.

3.  Bock R. Cell and Molecular Biology of Plastids // Heidelberg, Germany: Springer-Verlag, 2007. – 534 p.

4.  Brestic M., Zivcak M., Kunderlikova K.  et al. Low PSI content limits the photoprotection of PSI and PSII in early growth stages of chlorophyll b-deficient wheat mutant lines // Photosynthesis research, 2015  Vol. 125 – pp. 151–166.

5.  Colombo N., Emanuel C., Lainez V. et al.  The barley plastome mutant CL2 affects expression of nuclear and chloroplast housekeeping genes in a cell-age dependent manner. // Molecular Genetics and Genomics, 2008. Vol. 279. – pp. 403–414.

6.  Drouin G., Daoud H., Xia J. Relative rates of synonymous substitutions in the mitochondrial, chloroplast and nuclear genomes of seed plants // Molecular Phylogenetics and Evolution, 2008. Vol. 49.  № 3. – P. 827—831.

7.  Hirao T., Watanabe A., Kurita M. et al. A frameshift mutation of the chloroplast matK coding region is associated with chlorophyll deficiency in the Cryptomeria japonica virescent mutant Wogon-Sugi // Current genetics, 2009. Vol. 55. – pp. 311–321.

8.  Kramer D. M, Johnson G., Kiirats O., Edwards G.E., 2004. New fluorescence parameters for the determination of QA redox state and excitation energy fluxes // Photosynthesis Res., 2004. Vol. 79. – pp. 209-218

9.  Li N., Jia J., Xia C.  et al. Characterization and mapping of novel chlorophyll deficient mutant genes in durum wheat  // Breeding Science, 2013. Vol. 63. – pp. 169–175.

10. Stanley L., Forrester N. J., Govindarajulu R., Liston A., Ashman T. L.  Geographic patterns of genetic variation in three genomes of North American diploid strawberries with special reference to Fragaria vesca subsp. Bracteata // Botany, 2015. Vol. 93. № 9. – pp. 573—588.

11. Usatov A.V., Razoriteleva E. K., Mashkina E. V., Ulitcheva I. I. Spontaneous and Nitrosomethylurea-Induced Reversions in Plastome Chlorophyll Mutants of Sunflower Helianthus annuus L. // Russian Journal of Genetics, 2004. Vol.40. №2. – pp. 186—192.

 

 

Библиографическая ссылка

Макаренко М. С., Ковалевич А. А., Шамова Т. В., Казанцев М. Ю., Усатов А. В., Молекулярно-генетические и физиологические особенности хлорофилл-дефицитных мутантов подсолнечника с внеядерным типом наследования // «Живые и биокосные системы». – 2019. – № 27; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-27/article-4