Введение

В настоящее время развивается новая междисциплинарная наука – биотехнология сохранения растений, основной задачей которой является дополнение существующих традиционных методов сохранения биоразнообразия ex situ и in situ современными биотехнологическими инструментами. Сохранение ex situ включает хранение семян, полевой генбанк или «живые» коллекции, банки in vitro, хранение ДНК и пыльцы [4]. Данная работа является одним из этапов разработки протокола микроразмножения и сохранения in vitro шалфея австрийского.

Шалфей австрийский (Salvia austriaca Jacq.) – лекарственное, эфирномасличное, медоносное, декоративное степное травянистое растение, в Ростовской области встречающееся в приазовских разнотравно-дерновинно-злаковых целинных степях на высококарбонатных чернозёмах, в каменистых степях на карбонатных породах, на склонах балок, а также среди низкорослых степных кустарников. Имеет узкую экологическую амплитуду, малочислен в большинстве популяций. Лимитирующими факторами распространения являются уничтожение местообитаний при хозяйственной деятельности и антропогенные нарушения среды обитания. Включен в Красную книгу РО. Категория статуса редкости 2 а. Относится к видам с сокращающейся численностью в результате изменения условий существования или разрушения местообитаний [3].

Цель работы – изучить влияние различных фитогормонов на мультипликацию шалфея австрийского.

Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

  1. Оценить влияние различных фитогормонов на эффективность мультипликации шалфея австрийского;
  2. Предложить оптимальное сочетание фитогормонов для протокола микроразмножения шалфея австрийского.

Исследование проводилось на базе лаборатории клеточных и геномных технологий растений Ботанического сада ЮФУ.

 

Материалы и методы

В качестве первичного экспланта использовались семена из коллекции Ботанического сада ЮФУ. Семена стерилизовались в тканевых мешочках (рис. 1) по следующей схеме: 70 % раствор этанола (30 сек.), далее обработка 20 % раствором «белизны» в течение 2,5 мин. (3 % раствор в пересчете на гипохлорит натрия) [2] и промывка стерильной дистиллированной водой (3 раза по 10 мин.). После стерилизации семена высаживались на среду Мурасиге-Скуга (МС) [1] без добавления фитогормонов.

 

Рис. 1 – Подготовка семян к стерилизации

 

Стерилизация и высадка всех эксплантов осуществлялась в ламинар-боксе. Подсчет стерильных и проросших семян (рис. 2) осуществлялся через 14 дней.

 

Рис. 2 – Проростки шалфея австрийского на среде Мурасиге-Скуга

 

Далее проростки пересаживались на среду МС с добавлением таких фитогормонов как 6-бензиламинопурин (БАП), нафтилуксусная кислота (НУК) и индол-3-уксусная кислота (ИУК). Было протестировано 9 различных сочетаний фитогормонов: только БАП (0,5 мг/л, 1 мг/л, 1,5 мг/л), комбинация о,5 мг/л БАП и НУК (0,1 мг/л, 0,2 мг/л, 0,3 мг/л) и комбинация о,5 мг/л БАП и ИУК (0,1 мг/л, 0,2 мг/л, 0,3 мг/л). В качестве контроля использовалась среда МС без добавления фитогормонов. Оценка эффективности мультипликации проводилась через 21 день. Коэффициент мультипликации рассчитывался как количество новых побегов.

Стерилизация сред проводилась в автоклаве при температуре 121 ºС в течение 20 минут. В качестве гелеобразующего средства применялся агар-агар (7 г/л). PH сред доводилась до значения 5,8 с помощью 1 М KOH. Культуры помещались в условия 16-часового фотопериода при температуре 25 ºС.

Статистическая обработка данных осуществлялась посредством дисперсионного анализа по методу one-way ANOVA, с использованием в качестве апостериорного критерия Tukey HSD test (тест Тьюки). Все данные были обработаны в программной среде STATISTICA10, и являются достоверными при уровне значимости при p <0.05.

 

Результаты и обсуждение

На рисунке 3 представлены значения коэффициента мультипликации шалфея австрийского на средах с разными концентрациями фитогормонов.

 

Рис. 3 – Коэффициент мультипликации шалфея австрийского на средах с разной концентрацией фитогормонов.

 

Наибольший коэффициент мультипликации наблюдался на среде с добавлением 0,5 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК (2,17) (рис. 4), что статистически больше по сравнению с контролем и средой с добавлением только БАП. Концентрация ауксинов (ИУК и НУК) 0,3 мг/л приводила к снижению эффективности мультипликации шалфея австрийского.

Для других видов шалфея (Salvia guaranitica Benth., Salvia blancoana Webb & Heldr, Salvia wagneriana Polak) отмечено, что наибольший мультипликационный коэффициент наблюдается при культивировании узловых эксплантов на среде МС с добавлением 2.22 μM БАП, 1 мг/л БАП, 1.33-μM БАП соответственно [5—7].

 

  

Рис. 4 – Шалфей австрийский на среде МС

с добавлением 0,5 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК

 

На всех протестированных средах высота побега была приблизительно одинакова и статистически значимых отличий выявлено не было (рис. 5).

 

Рис. 5 – Высота побега шалфея австрийского на средах с разной концентрацией фитогормонов.

 

Для Salvia blancoana наибольшая длина побегов отмечается при добавлении 2 iP [1], тогда как для Salvia guaranitica Benth. при добавлении кинетина [2]. Данные фитогормоны не использовались в нашем исследовании из-за более высокой их стоимости.

Стоит отметить, что при большой концентрации фитогормонов наблюдаются физиологические аномалии (рис. 6), например витрификация побегов.

 

  

Рис. 6 – Наблюдаемые физиологические аномалии

 

Заключение

Таким образом, в данной работе было изучено влияние различных фитогормонов на мультипликацию шалфея австрийского. Наибольший коэффициент мультипликации наблюдался на среде МС с добавлением 0,5 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК. Данная концентрация фитогормонов рекомендуется для микроразмножения шалфея австрийского.

Следующий этап нашей работы – изучение влияния различных ауксинов на ризогенез шалфея австрийского и его дальнейшая акклиматизация к условиям закрытого и открытого грунта.

 

Список литературы:

  1. Егорова Н. А., Ставцева И. В., Митрофанова И. В. Морфогенез и клональное микроразмножение Salvia sclarea L. in vitro //Сборник научных трудов Государственного Никитского ботанического сада, 2011.  №. 133. http://scbook.nbgnscpro.com/download/133/4-133-2011.pdf
  2. Карпеченко К. А. и др. Введение в культуру in vitro шалфея клейкого (Salvia glutinosa L.) //Фундаментальные исследования, 2012. Т. 1. №. 5 (1). – С. 158-162  https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29866
  3. Красная книга Ростовской области: В 2 тт. / Администрация Ростовской области, Комитет по охране окружающей среды и природных ресурсов.  Ростов н/Д: Малыш, 2004.  Т. 2: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения грибы, лишайники и растения / Отв. ред. В. В. Федяева; авт.-сост. Т. И. Абрамова и др. – 333 с.
  4. Новикова Т. И. Использование биотехнологических подходов для сохранения биоразнообразия растений //Растительный мир Азиатской России, 2013. №. 2. – С. 12. http://www.izdatgeo.ru/pdf/rast/2013-2/119.pdf
  5. Cuenca S., Amo-Marco J. B. In vitro propagation of two spanish endemic species of salvia throught bud proliferation //In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2000.  Т. 36. №. 3. – С. 225-229. https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11627-000-0042-2
  6. Echeverrigaray S., Carrer R. P., Andrade L. B. Micropropagation of Salvia guaranitica Benth. through axillary shoot proliferation //Brazilian Archives of Biology and Technology, 2010.  Т. 53. №. 4. – С. 883-888. http://dx.doi.org/10.1590/S1516-89132010000400018
  7. Ruffoni B. et al. Micropropagation of Salvia wagneriana Polak and hairy root cultures with rosmarinic acid production //Natural product research, 2016. Т. 30. №. 22. – С. 2538-2544.  https://doi.org/10.1080/14786419.2015.1120725

 

 Spisok literatury

  1. Egorova N. A., Stavceva I. V., Mitrofanova I. V. Morfogenez i klonal'noe mikrorazmnozhenie Salvia sclarea L. in vitro //Sbornik nauchnyh trudov Gosudarstvennogo Nikitskogo botanicheskogo sada, 2011.  №. 133. http://scbook.nbgnscpro.com/download/133/4-133-2011.pdf
  2. Karpechenko K. A. i dr. Vvedenie v kul'turu in vitro shalfeya klejkogo (Salvia glutinosa L.) //Fundamental'nye issledovaniya, 2012. T. 1. №. 5 (1). – S. 158-162  https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29866
  3. Krasnaya kniga Rostovskoj oblasti: V 2 tt. / Administraciya Rostovskoj oblasti, Komitet po ohrane okruzhayushchej sredy i prirodnyh resursov.  Rostov n/D: Malysh, 2004.  T. 2: Redkie i nahodyashchiesya pod ugrozoj ischeznoveniya griby, lishajniki i rasteniya / Otv. red. V. V. Fedyaeva; avt.-sost. T. I. Abramova i dr. – 333 s.
  4. Novikova T. I. Ispol'zovanie biotekhnologicheskih podhodov dlya sohraneniya bioraznoobraziya rastenij //Rastitel'nyj mir Aziatskoj Rossii, 2013. №. 2. – S. 12. http://www.izdatgeo.ru/pdf/rast/2013-2/119.pdf
  5. Cuenca S., Amo-Marco J. B. In vitro propagation of two spanish endemic species of salvia throught bud proliferation //In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2000.  T. 36. №. 3. – S. 225-229. https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11627-000-0042-2
  6. Echeverrigaray S., Carrer R. P., Andrade L. B. Micropropagation of Salvia guaranitica Benth. through axillary shoot proliferation //Brazilian Archives of Biology and Technology, 2010.  T. 53. №. 4. – S. 883-888. http://dx.doi.org/10.1590/S1516-89132010000400018
  7. Ruffoni B. et al. Micropropagation of Salvia wagneriana Polak and hairy root cultures with rosmarinic acid production //Natural product research, 2016. T. 30. №. 22. – S. 2538-2544.  https://doi.org/10.1080/14786419.2015.1120725

Библиографическая ссылка

Васильченко Е. В., Середа М. М., Вардуни Т. В., Влияние различных фитогормонов на мультипликацию шалфея австрийского (Salvia austriaca Jacq.) // «Живые и биокосные системы». – 2019. – № 28; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-28/article-4