Морфогенез и регенерация в культуре оси соцветия Iris ensata Thunb.

Введение

В Японии ирис мечевидный культивируется более 500 лет. Это одна из популярных и любимых культур в стране. По данным Японского Общества Iris, впервые в Японии из незрелых зародышей отдаленных гибридов I. ensata успешно регенерированы растения в результате индукции соматического эмбриогенеза в каллусной культуре [1]. В 1991 г. Tcutomu Yabuya культивировал экспланты молодых побегов I. ensata на среде Мурасиге-Скуга, дополненной гормонами и сахарозой. Он наблюдал индукцию двух видов каллуса: зеленого и белого. Из зеленого каллуса были получены побеги. Введение активированного угля в питательную среду положительно влияло на образование корней у этих побегов [2].

С целью микроразмножения сортов I. ensata были использованы различные органы цветка в качестве эксплантов, в частности цветоножка. Регенерировать побеги не удалось. Ось соцветия была источником формирования корней с частотой 30% на безгормональной среде по прописи Мурасиге и Скуга [3].

Цель нашей работы — выявить морфогенетические особенности развития и регенерационную способность оси соцветия в культуре in vitro для культиваров I. ensata.

Материалы и методы

В качестве растительного материала использовали сорта и гибриды I. ensatа из коллекции НИИСС Россельхозакадемии г. Барнаул. Использовали цветки в фазе бутонизации при величине 20-30 мм (VI–VII этапы органогенеза). После стерилизации для культуры in vitro от генеративных побегов брали участки между кроющим листом и цветком. Стерильные сегменты цветоножки помещали на стандартную питательную среду MS [4], в которую вводили следующие фитогормоны: цитокининового типа действия — 6-бензиламинопурин (БАП) 4–8, 20 мкМ; ауксинового типа действия — α-нафтилуксусную кислоту (НУК) 3–5 мкМ. Экспланты выращивали в культуральной комнате, где поддерживалась температура 24–26? С, 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения — 2000–4000 лк. Субкультивирование тканей и органов проводили через 15–30 суток.
Провели серии анатомических срезов в разные сроки культивирования эксплантов с частотой 3–5 дней. Были приготовлены постоянные препараты по общепринятым методикам [5] в нашей модификации. Препараты просматривали на микроскопе МБ — 30 do MPI — 5 made in Poland при увеличении x100, x400. Фотографии были выполнены цифровым фотоаппаратом Sanyo VPC — S600.

Результаты и их обсуждение

Способность к регенерации у фрагментов оси соцветия I. ensata отмечена в основном на средах, где содержание цитокинина 6, 8, 20 мкМ (БАП). Исключение составляют среды с 4 мкМ БАП и 4 мкМ НУК. Все экспланты регенерировали побеги на средах с 4 мкМ БАП 4 мкМ НУК и 8 мкМ БАП 3 мкМ НУК. Отличием явилось время прохождения регенерационных процессов: на средах с 8 мкМ БАП 3 мкМ НУК — через 18 суток после введения в культуру in vitro, на средах с 4 мкМ БАП 4 мкМ НУК — через 28 суток. Удвоенное содержание БАП (8 мкМ) первого варианта среды по сравнению со вторым (4 мкМ), вероятно явилось причиной сокращения времени прохождения регенерационных процессов на 10 суток.

Изучение анатомического строения оси соцветия I. ensata гибрида 28 (VI–VII этапа органогенеза) показало следующее. Генеративный побег покрыт эпидермой, образованной одним слоем клеток с кутикулой. Эпидермальные клетки плотно сомкнутые друг с другом, имеют таблитчатую форму. Антиклинальные стенки клеток ровные (рис. 1).

Рисунок 1 — Анатомическое строение оси соцветия I. ensata гибрид 28 (VI–VII этапы органогенеза), ткани первичной коры: а) увел. x100; б) увел. x400

Первичная кора оси соцветия I. ensata гибрид 28 на данном этапе развития состоит из 15 слоев паренхимных клеток. Эти клетки имеют почти сферическую форму с тонкими целлюлозными стенками. Цитоплазма клеток первичной коры содержит продукты обмена веществ, вероятно, крахмальные зёрна. Пигментных включений не наблюдается. На границе с центральным цилиндром клеток склеренхимы не обнаружено. В толще паренхимного слоя равномерно располагаются полости имеющие диаметр, который в несколько раз превышает диаметр соседних паренхимных клеток первичной коры (рис. 2).

Рисунок 2 — Анатомическое строение оси соцветия I. ensata гибрид 28 (VI -VII этапы органогенеза) (Увел. x100)

При малом увеличении (увеличение x100) хорошо видно кольцо клеток, представляющее собой перицикл. Перицикл является наружным слоем центрального цилиндра, внутрь от которого, среди паренхимных клеток сердцевины расположены небольшие коллатеральные пучки. Между клетками паренхимы первичной коры, ближе к перициклу видны очаги деления (интеркаллярная меристема), так как на данном этапе органогенеза рост генеративного побега ещё не закончен (рис. 3).

Рисунок 3 — Анатомическое строение оси соцветия I. ensata гибрид 28 (VI -VII этапы органогенеза); а) первичная кора и многорядный перицикл. (Увел. x100), б) очаг интеркалярной меристемы. (Увел. x400).

У большинства видов ириса наиболее интенсивно цветонос растет в предцветный период. Причем, у генеративного побега преобладал вставочный или интеркаллярный рост, то есть рост за счет интеркаллярных меристем. Ткани интеркаллярных меристем нельзя назвать совершенно недифференцированными. В этих меристемах в период их активного роста уже имеются проводящие пучки [6].

Так как ось соцветия I. ensata гибрида 28 имеет многогранную форму в поперечном сечении, пограничная зона между первичной корой и центральным цилиндром также имеет форму многогранника на срезе. По сторонам многогранника сплошной линией расположены проводящие пучки. Клетки перицикла располагаются над пучками и между ними.

При анатомическом изучении, отмечено, что всё пространство центрального цилиндра занято основной паренхимой, среди которой располагаются закрытые проводящие пучки. Клетки паренхимы изодиаметрической формы. Проводящие пучки центрального цилиндра более крупного размера, чем пограничной зоны.

При изучении процессов морфогенеза у эксплантов I. ensata на 4 день культивирования был отмечен рост за счет растяжения. Число клеточных слоёв паренхимы первичной коры не изменилось, осталось в пределах 15.

На 7–12 сутки культивирования у экспланта в области перицикла была отмечена зона меристематической активности в виде сплошного кольца. Множественные очаги деления в паренхиме первичной коры не одинаковой степени развития. За счет роста и давления внутренних слоев клеток, край экспланта становиться не ровным. Отмечено образование полиад (несколько делящихся клеток под общей оболочкой) (рис. 4).

Рисунок 4 — Анатомическое строение оси соцветия I. ensata гибрид 28 на 7 сутки развития; а) меристематическая активность в зоне перицикла (Увел. x100), б) полиады. (Увел. x400)

На 15 сутки культивирования слой перицикла сохраняется. Меристематические очаги развиваются как в толще паренхимы первичной коры, так и с внешней стороны перицикла. В первичной коре значительное количество клеток с включениями, вероятно крахмальные зерна.
Первые визуальные признаки регенерации побегов у эксплантов оси соцветия I. ensata были отмечены на 18 сутки культивирования. Побеги формировались в паренхиме первичной коры и в области перицикла. При этом перицикл не был разрушен (рис. 5).

Рисунок 5 — Внешний вид и анатомическое строение оси соцветия I. ensata гибрид 28 на 18 сутки; а) внешнее строение экспланта, б) побеги образованные de novo, продольный срез, в) поперечный срез побега (Увел. x100)

При гистологическом изучении процессов в эксплантах оси соцветия I. ensata гибрид 28 нами установлено однозначно эндогенное заложение побегов. Образовавшиеся побеги в своём росте прокладывают себе путь сквозь клеточные слои материнского экспланта.

Таблица 1 — Этапы морфогенеза в эксплантах оси соцветия I. ensata гибрид 28 с 8 мкМ БАП и 3 мкМНУК

Выводы

1. В эксплантах оси соцветия I. ensata на питательных средах с содержанием 4–8 и 20 мкМ БАП 3–5 мкМ НУК морфогенез проходил по типу геммогенеза, минуя стадию каллусообразования.
2. Скорость развития регенерационных процессов в эксплантах оси соцветия зависела от концентрации гормонов в питательной среде и от генотипа источника.
3. Анатомическое строение генеративного побега на I. ensata гибрид 28 на VI–VII этапах органогенеза типично для выполненного стебля однодольных растений.
4. Меристематическая активность (возникновение полиад) в эксплантах I. ensata гибрид 28 отмечалась, начиная с 10 дня культивирования, и была ограничена областью перицикла и внутренними слоями клеток первичной коры.
5. Системы тканей побегов в экспланте оси соцветия I. ensata гибрид 28 развивались как из клеток перицикла, так и из клеток паренхимы первичной коры.
6. Побеги, развившиеся на эксплантах оси соцветия I. ensata гибрид 28 имели исключительно эндогенное происхождение.

Литература

1. Yabuya T., Yavagata. Embryo growth and Cultural Condition in Iris ensata thumb. //Japan J. Breed., 1981. ? 31 (4). ? P. 377–382.
2. Yabuya T, Ikeda Y., Adachi T. In vitro propagation of japanese garden iris ensata Thunb. //Euphytica. 1991. ? 57. ? P. 77–82.
3. Kawase K, Mizutani H, Yoshioka M, Fukuda S Shoot formation on floral organs of Japanese iris in vitro //Journal of the Japanese Society for Horticultural 1995. ? Science 64. ? P. 143–148.
4. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassaya with Tobacco Tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. ? v. 15. № 4. ? Р. 473–480.
>
5. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. — М.: Изд-во МГУ, 2004. — 312 с.
6. Эсау К. Анатомия растений. Изд-во Мир. Москва. 1969. — 564 с.