Цитоанатомическое изучение изменений в тканях растений Solanum tuberosum и Nicotiana tabacum при поражении вирусной инфекцией

Введение

Вирусные болезни картофеля широко распространены во всех зонах возделывания картофеля в Казахстане, при этом потери урожая могут достигать 50% [8]. При поражении вирусами происходит видоизменение клеток растений картофеля во всех его органах, ухудшается качество клубней. Поражённость растений вирусной инфекцией во многом зависит от сортовых особенностей анатомического строения органов растений картофеля. Поэтому при селекционной работе картофеля необходимо учитывать реакцию растений на внедрение вирусной инфекции [9].

Цель исследования

Целью настоящих исследований являлось изучение цитоанатомических изменений в тканях растений Solanum tuberosum и Nicotiana tabacum при поражении вирусной инфекцией.

Материалы и методы

Объектами исследований являлись проросшие клубни, листья и стебли картофеля сортов Латона, Романо, Кокшетауский ранний. В качестве тест-растений для накопления вирусной инфекции были использованы растения и каллусные ткани линий Nicotiana tabacum (N. tabacum).

Для получения первичной культуры каллуса использовались верхние молодые листья N. tabacum, которые отделяли, промывали дистиллированной водой и дезинфицировали, последовательно инкубируя их в 20% эталоне (1 мин), 5% растворе хлорной извести (15 мин) и 5% растворе хлорамина (20 мин). Листья затем 3 раза промывали стерильной водой и разрезали на сегменты квадратной формы размером 0,5–0,7 мм.

Экспланты высаживали в чашки Петри с агаризованной питательной средой на минеральной основе по Мурасиге и Скуга (МS), содержащей наряду со стандартными ингредиентами следующие компоненты: кинетин — 2 мг/л, 2,4-Д — 0,5 мг/л, индолилуксусная кислота — 1 мг/л, сахароза — 2% и агар-агар — 0,7%. Каллус выращивали в условиях постоянного освещения (1500 лк), при температуре 25–26°С и 70%-ной относительной влажности воздуха. Пассирование каллуса на свежую питательную среду осуществлялось через каждые 30 дней.

Пересадку первичной каллусной ткани проводили через 4 недели, при этом учитывались следующие показатели: число эксплантов, образующих каллус, интенсивность каллусогенеза, формирование морфогенного и неморфогенного каллуса, прирост сырой массы, цвет и консистентность.

Каллусные ткани N. tabacum тестировали методом двойного наслоения антител («сэндвич-вариант» ИФА) по стандартной методике [1, 3]. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света (ASYS Expert 96, Австрия) при длине волны 492 нм. При проведении анализа применялись диагностические наборы для определения вирусов картофеля ГНУ Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. А. Г. Лорха РАСХН.

Срезы тканей растений картофеля делали с помощью салазочного микротома, окуляр-микрометром определялась толщина перидермы, длина устьиц, размеры клеток хлоренхимы, крахмальных зёрен, проводилось морфометрическое изучение каллусных клеток [4].

Результаты и обсуждения

Изменения в растениях картофеля и табака при поражении вирусной инфекцией, обусловлены изменением физиологических процессов в растениях, что приводит к появлению патологических признаков, определяемых цитологическими и гистологическими анализами. Как правило, к числу морфологических признаков относят: посветление жилок листовой пластинки, появление мозаики, иногда накопление антоциана и жёлтых пигментов [5].

При изучении строения клеток основной паренхимы клубней картофеля здоровых и поражённых вирусной инфекцией различных сортов были выявлены следующие закономерности.

В коровой и сердцевинной паренхиме клубня в клетках изменялись размеры крахмальных зёрен. В клетках паренхимы клубня встречалось по 2–3 сложных и до 18 простых и полусложных зёрен с эксцентрической слоистостью. Размеры крахмальных зёрен в паренхиме клубней, поражённых вирусной инфекцией уменьшались, что более чётко проявлялось на размерах простых зёрен (таблица 1).

Таблица 1 — Характеристика крахмальных зёрен в клетках основной паренхимы клубней картофеля при t₀₅ = 2, 06

По таблице 1, количество и размеры крахмальных зерен безвирусных клонов сорта Латона превышали пораженные вирусами клоны, которые были очень мелкие и достигали 0, 35 мкм. Клоны картофеля сорта Романо, пораженных смесью вирусов, отличались наименьшим количеством крахмальных зерен в клетке и их размеры не превышали 0, 5–1, 5 мкм по сравнению с контролем.

По камбиальному кольцу клубня картофеля располагались проводящие пучки. Основную массу клубня составляли паренхима внутренней флоэмы, перимедуальной зоны сердцевины и собственно сердцевина. Паренхима клубня имела узкую полоску мелких меристематических клеток, к наружной части от которой, располагались несколько ситовидных трубок, во внутрь, от 1 до 6 слаборазвитых сосуда, что соответствует данным научной литературы [2]. В наших исследованиях в поражённых вирусной инфекцией клубнях картофеля в анатомическом строении проводящих тканей изменений не выявлено.

В связи с нарушением ростовых процессов в растениях картофеля при поражении вирусами могут изменяться размеры его клеток [7]. Нами была выявлена закономерность в размерах покровных тканей у сортов свободных от инфекции и несущих комплекс вирусной инфекции. Как известно размеры и особенности покровной ткани клубней картофеля напрямую связаны с процентом гибели их при хранении [6]. В ходе исследований нами установлено, что перидерма состояла из таблитчатых клеток, расположенных параллельными рядами, оболочки её покрывались пробкой, межклетники отсутствовали. Толщина клеток перидермы изменялась от 35 до 45 мкм. Как видно из таблицы 2 при поражении вирусной инфекцией уменьшались число слоёв пробки и размеры перидермы.

Таблица 2 — Характеристика клеток перидермы клубня картофеля при t₀₅ = 2, 09

Анализ эпидермальных клеток проростков поражённых растений картофеля показал, что эпидермис клеток картофеля состоял из прозенхимных клеток. Отмечалось увеличение количества кроющих трихом на эпидермисе вирусных растений. Ядро было расположено по периферии клетки эпидермиса. Все клетки первичной покровной ткани имели антоциановое окрашивание.

У клеток эпидермиса листьев, поражённых вирусной инфекцией, наблюдалось измельчение клеток, недостаточное развитие. На срезах листьев, поражённых вирусной инфекцией, наблюдалось меньшее количество слоёв столбчатой и губчатой паренхимы. Уменьшались размеры хлоропластов в поражённых вирусами листовых пластинках. В листьях растений картофеля, поражённых вирусом, наблюдалось уменьшение слоёв палисадной хлоренхимы. В клетках хлоренхимы, пораженных вирусами растений картофеля, наблюдалось уменьшение размеров ядра, увеличивались размеры вакуолей. Количество хлоропластов в клетках снижалось по сравнению с клетками здоровых растений, встречались аморфные включения неопределённой формы.

В целях сравнительного изучения анатомических изменений в тест-растениях N. tabacum нами были проведены исследования каллусной ткани этого растения. В таблице 3 представлены результаты детекции вируса PVY в клетках каллуса методом ИФА (таблица 3).

Таблица 3 — Результаты тестирования каллуса Nicotiana tabacum вирусом картофеля PVY

Результаты тестирования каллуса N. tabacum подтвердили отсутствие инфекции на варианте безвирусного каллуса. Оптическая плотность каллуса, инфицированного PVY, несколько превышала значение позитивного контроля.

В ходе проводимых исследований нами была изучена каллусообразующая способность каллусных культур, индуцированных в зависимости от зараженности PVY (таблица 4).

Таблица 4 — Индукция каллусогенеза из листовых эксплантов Nicotiana tabacum на 10-е сутки при t₀₅ = 2, 09

В соответствии с данными таблицы 4, на десятые сутки культивирования листовых эксплантов на питательной среде МS, оба варианта изучаемых эксплантов показали высокий процент каллусогенеза.

Каллусная ткань была окрашена в зеленый цвет в связи с культивированием в условиях постоянного освящения. За время эксперимента было осуществлено 4 пассажа, в ходе которых проводились наблюдения за интенсивностью нарастания каллусной ткани. Результаты интенсивности роста безвирусных и инфицированных PVY каллусных культур N. tabacum представлены в таблице 5.

Таблица 5 — Интенсивность роста пораженных PVY каллусных культур N. tabacum t₀₅ = 2, 09

Полученные результаты свидетельствовали, что интенсивность нарастания безвирусного каллуса на 21% выше, чем каллусной ткани пораженного PVY.

При микроскопическом исследовании изучаемых вариантов опыта было выявлено, что при метаморфозе глобулярной ткани в рыхлую, ранее плотно связанные друг с другом меристематические клетки глобулярного каллуса обособлялись и увеличивались в размерах (рисунок 1).

Рисунок 1 — Каллус растений и клетки глобулярного каллуса Nicotiana tabacum (х100, х600)

Для выяснения клеточных основ длительного сохранения тотипотентности изучали гистологическое строение длительно культивируемых рыхлых каллусов. Вируссодержащий морфогенный каллус табака состоял из клеток сферической или слегка овальной формы (длиной 6 мкм, шириной 2, 6 мкм). В некоторых клетках имелись кристаллы, ядро располагалось в центре клетки, или было слегка сдвинуто к периферии. Некоторые клетки каллуса удлинялись (длина до 15, 8 мкм, ширина — 2, 7 мкм) и прорастали в длинные трубкообразные образования, с крючкообразными и сосочковидными выростами, в этих клетках ядро располагалось на периферии клетки, в центре клетки располагалась крупная вакуоль. Более мелкие клетки имели округлую форму. Встречались также клетки неправильной формы (уродливые). Размеры клеток вируссодержащего и безвирусного морфогенного каллуса были практически одинаковы.

Научной новизной полученных результатов является изучение новых особенностей цитоанатомических изменений в тканях растений Solanum tuberosum и Nicotiana tabacum в зависимости от поражения вирусами.

Практическая значимость полученных результатов заключается в возможности применения установленных типов реакций растений в селекционном процессе при испытании сортов картофеля на устойчивость к вирусам.

Выводы

1. Всего было изучено около 500 образцов растений картофеля и табака.
2. Действие вирусов на поражённое растение картофеля проявляется остановкой роста и деформированием клеток растений, изменением их структуры.
3. В клубнях картофеля, поражённых вирусной инфекцией, уменьшается количество и размеры крахмальных зёрен.
4. Перидерма клубней картофеля, поражённых вирусной инфекцией, имеет размеры на 15 и более процентов меньше, чем у здоровых растений, число её слоёв также снижается.
5. Каллусообразующая способность листовых эксплантов N. tabacum не зависит от зараженности PVY. Интенсивность роста безвирусного каллуса на 21% выше, чем каллуса, инфицированного PVY.
6. Вируссодержащий морфогенный каллус табака состоит из клеток удлиненной, часто уродливой формы, некоторые содержат аморфные включения.

Литература

1. Анисимов Б. В. Фитопатогенные вирусы и их контроль в семеноводстве картофеля: практическое руководство. — М.: ФГНУ Росинформагротех, 2004. — С. 3–18.
2. Вавилов П. П. Растениеводство. — М.: Колос, 1986. — 519 с.
3. Контроль качества и сертификация семенного картофеля: Практическое руководство. — М.: ФГНУ Росинформагротех, 2003. — С. 157–174.
4. Паушева З. П. Практикум по цитологии растений. — М.: Агропромиздат, 1988. — 270 с.
5. Попкова К. В. Болезни картофеля. — М.: Колос, 1980. — 303 с.
6. Попкова К. В., Качалова З. П. Практикум по иммунитету растений. М.: Колос, 1984, 176 с.
7. Попкова К. В. Общая фитопатология. — М.: Дрофа, 2005. — 445 с.
8. Хасанов В. Т., Муранец А. П., Оразбаева Г. К., Букаев А. Инокуляция, накопление и идентификация вируса PVY картофеля в тест-растениях Nicotiana tabacum// Вестник КАТУ им. С.Сейфуллина. — 2012, № 4 (75). — С. 31–36.
9. Швидченко В. К., Созинова Л. Ф. Оздоровление, размножение и диагностика в картофелеводстве. — Астана, 2000. — 163 с.

Literature

1. Anisimov B. v. Fitopatogennye virusy i ikh kontrol v semenovodstve kartofelya: prakticheskoe rukovodstvo. — M.: FGNU Rosinforagrotekh, 2004. — S. 3–18.
2. Vavilov P. P. Rastenievodstvo. — M.: Kolos, 1986. — 519 s.
3. Kontrol kachestva i sertifikatsiya semennogo kartofelya: Prakticheskoe rukovodstvo. — М.: FGNU Rosinformagrotekh, 2003. — S. 157–174.
4. Pausheva Z. P. Prakticum po tsitologii rastenii. — М.: Agropromizdat, 1988. — 270 s.
5. Popkova K. v. Bolezni kartofelya. — М.: Kolos, 1980. — 303 s.
6. Popkova K. v. , Kachalova Z. P. Prakticum po immunitetu rastenii. М.: Коlos, 1984, 176 s.
7. Popkova K. v. Obshaya fitopatologiya. — M.: Drofa, 2005. — 445 s.
8. Khasanov v. T., Muranets A. P., Orazbaeva G. K., Bukaev A. Ivokulyatsiya, nakoplenie i identifikatsiya virusa PVY kartofelya v test-rasteniyakh Nicotiana tabacum // Vestnik KATU im. S. Seifullina. — 2012, № 4 (75). — S. 31–36.
9. Shvidchenko v. K., Sozinova L. F. Ozdorovlenie, razmnozhenie i diagnostika v kartofelevodstve. — Аstana, 2000. — 163 s.