Введение

В последние десятилетия появились исследования, указывающие на особенности морфофизиологических показателей эритроцитов периферической крови на ранних критических этапах постнатального онтогенеза, указывающие на  возможность суждения о стадиях онтогенеза по показателям структуры и функции эритроцитов [ 5, 6]. Между тем, состояние эритроцитов — чувствительных индикаторов изменений нормального хода физиологических, биохимических и биофизических процессов в онтогенезе, особенно позднем, изучены недостаточно. Исследование возрастных особенностей структурно-функциональной организации эритроцитов при хроническом действии экстремальных, особенно токсических, факторов, может иметь, помимо теоретического, диагностическое и прогностическое значение для оценки биологической  зрелости и способности организма к адаптации.

Цель исследования

Целью настоящей работы было экспериментальное изучение возрастных особенностей морфофизиологической организации эритроцитов периферической крови белых крыс в норме и при окислительном стрессе, вызванном хроническим действием сероводородсодержащих газовых поллютантов (СВСГ).

Материал и методы

 Опыты поставлены на беспородных белых крысах-самцах: молодых (возраст — 180 дней) и старых (820 дней). Животные были разделены по две группы соответственно для каждой возрастной группы: интактные крысы (контроль), СВСГ — сероводородсодержащий газ ингаляционно в дозе 150 мг/м3 (по H2S), экспозиция 240 мин в течение 6 недель по 5 дней в неделю. Ингаляционные затравки животных осуществлялись в лаборатории кафедры патофизиологии Астраханской государственной медицинской академии в специальных камерах производства Московского института профзаболеваний им. Эрисмана объемом 200 л [9]. Микроклимат в камере в течение экспериментов поддерживался при температуре 27°С и влажности в начале эксперимента 64 %, в конце — 72—74 %. С целью подтверждения развития стресс-реакции определяли количество эозинофильных гранулоцитов в периферической крови с использованием эозинопенической пробы Торна [8]. Изучались следующие гематологические показатели: величина гематокрита (HCT) — методом центрифугирования в микрокапиллярах, обработанных антикоагулянтом, на специальной микроцентрифуге; определение количества эритроцитов (RBC) периферической крови — с применением камеры Горяева; определение содержания гемоглобина (HGB) с применением гемоглобинцианидного спектрофотометрического метода (Drabкin); вычисление цветного показателя (ЦП) традиционным клиническим методом. Определяли следующие индексы эритроцитов с помощью методик, применяемых в лабораторной  практике [2]: средний объем эритроцитов (MCV в фл); среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН в пг); среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (МСНС в г/дл); показатель анизоцитоза эритроцитов (RDW в %). Определение морфологических и геометрических показателей эритроцитов производили с помощью аппаратно-программного комплекса «МЕКОС-Ц» в программе «Эритроцитометрия» в монослое мазков периферической крови, окрашенных по Гимза-Романовскому, в составе комплекса — тринокулярный микроскоп «NIKON», цифровая фотокамера «Delta-Pix-300» , персональный компьютер.

При анализе геометрических показателей оценивали: средний диаметр эритроцита по формуле S = N/K-1, где N — сумма всех пикселей, составляющих объект, К-1 — коэффициент линейного разрешения (число пикселей на 1 мкм); фактор формы эритроцитов как отношение квадрата диаметра к площади поперечного сечения эритроцита: F = L2/S — характеристика изрезанности контура клетки; поляризацию эритроцита (характеристика степени эллиптичности) по формуле: Р*2х (а-в)(а+в), где а — наибольшая, в — наименьшая величина диаметра эритроцита, распластанного по стенке; формулу эритроцита (распределение на основные типы: нормальные, обратимо измененные, необратимо измененные, патологические (в у.е.). Для оценки свободнорадикального окисления и, в связи с этим, степени изменения проницаемости мембраны эритроцитов определяли уровень перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ), используя методику А.А.Покровского и А.А. Абрарова (1964) в модификации А.Е. Лазько и соавт. (1993) [4].

Результаты и обсуждение

По эозинопеническому критерию длительное воздействие сероводородсодержащего газа оказалось стресс-реализующим, что подтверждалось результатами пробы Торна. Так, у молодых животных после воздействия СВСГ число эозинофилов в периферической крови уменьшалось с 395, 0 ± 14, 6 (в контроле) до 262, 4 ± 10, 1 в 1мм(р < 0, 05); у старых крыс соответственно с 495, 1 ± 21, 2 до 415, 3 ± 14, 3 в 1 мм3 (р < 0, 05).При сравнении возрастной динамики количества эритроцитов периферической крови крыс найдено их увеличение у старых животных на 37 % в сравнении с молодыми (р < 0, 001, таблица 1). Эритроцитоз, характерный для позднего онтогенеза, может быть следствием компенсаторного усиления эритропоэза и выходом в периферическое русло крови клеток со значительно меньшим индивидуальным объемом (р < 0, 001), что и наблюдалось в наших опытах, а также повышенным гемолизом эритроцитов при старении (р < 0, 01 в сравнении с молодыми), индуцированным усилением свободнорадикальных процессов, характерных для этапа инволюции. Значительное уменьшение объема эритроцитов при старении компенсируется ростом их концентрации в крови, что, в какой-то мере, способствует поддержанию общей дыхательной поверхности циркулирующей крови. Как известно, удаление неполноценных клеток из крови — генетически контролируемая программа. В связи с этим при старении, возможно, имеет место не только выраженное старение эритроцитов, но и недостаточно эффективное удаление дефектных клеток из периферического русла крови.

Таблица 1 — Гематологические показатели у молодых и старых крыс при действии сероводородсодержащего газа 

Показатели

Молодые

Старые

Контроль

СВСГ

Контроль

СВСГ

HCT, %

37, 81 ± 0, 395

39, 80 ± 1, 933*

43, 13 ± 0, 641Δ

37, 25 ± 0, 707*

RBC, 1012

6, 42 ± 0, 065

7, 05 ± 0, 223*

8, 8 ± 0, 014Δ

4, 98 ± 0, 132*

HGB, г/л

14, 34 ± 0, 533

15, 42 ± 0, 094*

14, 78 ± 0, 164

10, 95 ± 0, 314*

ЦП

1, 19

1, 12

0, 89

1, 17

RDW, %

12, 65

6, 20

14, 25

9, 34

MCV, фл

58, 8 ± 1, 50

56, 38 ± 1, 061

49, 02 ± 2, 472Δ

75, 22 ± 2, 507*

MCHC, г/дл

38, 08 ± 1, 267

39, 41 ± 1, 635

34, 34 ± 0, 669Δ

29, 45 ± 0, 945*

MCH, пг

22, 36 ± 0, 808

22, 11 ± 1, 272

16, 86 ± 0, 264Δ

22, 03 ± 0, 583*

ПГЭ, %

3, 97 ± 0, 130

4, 96 ± 0, 061*

4, 6 ± 0, 155Δ

7, 23 ± 0, 548* 

Примечание: * — р < 0, 05—0, 001 в сравнении с контролем; Δ — р < 0, 05—0, 001 в сравнении с другой возрастной группой 

Изучение степени анизоцитоза показало несколько большую гетерогенность размеров эритроцитов у старых крыс в сравнении с молодыми и значительное (втрое) увеличение аномальных форм эритроцитов у старых животных. Старение организма не сказалось на общем уровне гемоглобина крови, однако у старых крыс среднее содержание гемоглобина (MCH) и средняя концентрация гемоглобина в клетке (МСНС) значительно уменьшились в сравнении  с молодыми животными (р < 0, 001), что свидетельствует о развитии  гипохромии, вызванной нарушением синтеза гемоглобина [2]. Это подтвердилось и данными о некотором снижении у старых крыс величины гематокрита (на 15—20 % в сравнении с молодыми животными).

Результаты экспериментов показали наличие слабой корреляции между количеством эритроцитов (RBC) и их индивидуальным объемом (МСV): у молодых крыс r = +0, 21, у старых — r = -0, 10, что соответствует корреляции между RBC и MCV у взрослого человека.

Изучение возрастной динамики адаптивных возможностей выявило эзинофилию у старых крыс (р < 0, 05, на 25 % выше в сравнении с молодыми животными), что свидетельствует о возрастном снижении стресс-реактивности, связанном с возможным возраст зависимым ослаблением секреторной активности надпочечников [1]. Известно, что основной мишенью активных кислородных метаболитов, уровень которых возрастает при старении, является мембрана эритроцитов. В наших экспериментах уровень перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) у старых крыс оказался значительно большим, чем у молодых (р < 0, 01), что указывало на возрастное истощение антиоксидантной системы эритроцитов и их микроокружения. При характеристике онтогенетических особенностей морфометрических показателей эритроцитов были найдены существенные возрастные различия количества аномальных форм эритроцитов: у молодых крыс — 2, 44 %, у старых — 8, 40 %. Такая ситуация характерна для условий напряжения эритропоэза, формирующегося при усилении гемолиза эритроцитов [7] и усиления свободнорадикальных процессов в позднем онтогенезе. По мнению других авторов в механизме увеличения аномальных форм эритроцитов участвует снижение внутриклеточной АТФ (АТФ-зависимые системы). Характерно, что заметно больший процент аномальных клеток у старых крыс представляли сфероциты, появление которых в крови связано с изменением содержания спектрина, приводящего к нарушению устойчивости эритроцитарных мембран [3].

В ходе морфометрических исследований у молодых животных не выявлено существенных отклонений от нормы ни одного из геометрических показателей. При этом, у старых крыс существенно увеличилась площадь эритроцитов (р < 0, 001), средний диаметр (р < 0, 001), отмечены некоторые изменения уровня поляризации. Увеличение среднего диаметра эритроцитов определило обратную корреляцию между этим показателем и средним объемом эритроцитов при старении (r = -0, 71). Старение способствовало некоторому уменьшению эластичности эритроцитов (у молодых крыс — 0, 091 ± 0, 015 у.е.; у старых — 0, 072 ± 0, 017 у.е.).

Далее, после действия СВСГ, полученные результаты отличались рядом возрастных особенностей как в отношении концентрации эритроцитов (RBC), так и гематокрита (HCT) и объема клеток (MCV): у молодых животных СВСГ привел к эритроцитозу (р < 0, 001) и увеличению HCT, некоторому уменьшению MCV,  увеличению общего содержания гемоглобина (HGB) и изменению других показателей. В популяции эритроцитов старых животных общее количество эритроцитов, напротив, существенно уменьшилось (р < 0, 001), как и среднее содержание гемоглобина в одном эритроците (МСН) (р < 0, 001), а индивидуальный объем эритроцитов (MCV) резко возрос (на 53 % в сравнении с контролем — р < 0, 001). Эти данные свидетельствуют о значительном нарушении газотранспортной функции эритроцитов и гемоглобинсинтезирующих процессов эритроидных элементов костного мозга.

Результаты анализа корреляционных отношений между MCV и RBC у молодых крыс при действии СВСГ демонстрируют формирование слабой положительной корреляции (r = 0, 33). В тех же условиях у старых крыс обозначилась высокая отрицательная взаимосвязь (r = -0, 82). Изучение степени анизоцитоза (RDW) у крыс, подвергшихся  действию СВСГ, показало на уменьшение этого показателя, особенно у молодых крыс — на 51 %, у старых — на 45 %. Под влиянием СВСГ у молодых крыс общий уровень гемоглобина увеличился (р < 0, 01). Показатели МСН и МСНС изменились незначительно. В тех же условиях у старых крыс СВСГ резко уменьшил содержание HGB (р < 0, 001) и способствовал увеличению МСН и МСНС (р < 0, 001 в обоих случаях).

Оценка морфологии эритроцитов играет важную роль в анализе изменений функционального состояния эритроцитов и распознавании патогенетического варианта, в том числе в анализе гипоксического состояния, вызванного воздействием СВСГ. Такое воздействие в наших опытах вызвало уменьшение уровня дискоцитов вне зависимости от возраста (у молодых — на 22 %, у старых крыс — на 18 % в сравнении с контролем). В 4, 7 раза возросло количество обратимо и необратимо измененных форм эритроцитов у молодых крыс и в 4 раза — у старых. При этом в 12 раз (в сравнении с контролем) возросло количество эхиноцитов у молодых и появились эхиноциты в крови старых крыс.

Следует особо подчеркнуть большую, чем у старых животных реактивность крови молодых крыс к действию СВСГ, что, вероятно, связано с менее зрелыми механизмами адаптации к действию неблагоприятных факторов и менее выраженными компенсаторными возможностями эритропоэза на ранних этапах постнатального онтогенеза. Это нашло подтверждение в развитии более выраженной у молодых крыс эозинопении под влиянием СВСГ (у молодых 262, 4 ± 10, 11, в контроле 395, 0 ± 15, 64, р < 0, 01; у старых 415 ± 21, 06, в контроле 495, 1 ± 30, 62, р < 0, 05).

Анализ изменений геометрических показателей функционального состояния эритроцитов и их изменений под влиянием серосодержащего газа  показал значительное увеличение площади эритроцитов (р < 0, 01) без существенных изменений других геометрических показателей у молодых животных. В тех же условиях у старых крыс под действием СВСГ значительно уменьшились площадь эритроцитов (р < 0, 001), средний диаметр (р < 0, 01) и поляризация клеток (р < 0, 01). При этом фактор формы значительно превзошел тот же показатель у молодых крыс (р < 0, 01).

Выводы

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о возрастзависимых отклонениях от физиологического уровня преобладающего числа исследованных морфофизиологических параметров функционального состояния эритроцитов периферической крови, указывая на отсутствие стабильности этих показателей в позднем онтогенезе, на значительные нарушения газотранспортной функции эритроцитов и гемоглобинсинтезирующих процессов, особенно четко выраженных при ингаляции животных сероводородсодержащим газом. При старении обнаружены изменения морфофизиологических показателей эритроцитов, характерные для микроцитарной анемии: увеличение гематокрита, числа эритроцитов, уменьшение индивидуального объема клеток, среднего содержания и средней концентрации эритроцитов при сохранении общего уровня гемоглобина, увеличение количества аномальных форм и геометрических показателей эритроцитов, рост анизоцитоза.

Литература

  1. Агаджанян, Н. А. Физиология человека / Н. А. Агаджанян, Л. З. Тель, В. И. Циркин, С. А. Чеснокова  // Санкт-Петербург. Изд-во «СОГИС», 1998. С. 500—503.
  2. Бондарь, Т. П. Лабораторная гемоцитология: методы исследования и клинико-диагностическое значение изучения эритроцитов / Т. П. Бондарь, О. И. Запорожцева, Т. В. Карчинская, Е. В. Верщак // Ставрополь. Изд-во  СГУ, 2007. — 62 с.
  3. Зинчук, В. В. Дифференцируемость эритроцитов: физиологические аспекты / В. В. Зинчук // Успехи физиологических наук. — 2001.— Т.32, №3. — С. 66—78.
  4. Лазько, А.Е. Состояние газотранспортирующего компартмента мимтемы микроциркуляции при воздействии серосодержащего газа / А.Е. Лазько, А.А. Резаев // Материалы юбилейной научной конференции Астраханского государственного медицинского института // Астрахань. Изд-во АГМИ, 1993. — С. 179—182.   
  5. Леонова, В. Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека / В. Г. Леонова //  Новосибирск. Изд-во « Наука», Сибирское отделение, 1987. — 242 с.
  6. Новожилов, А. В. Динамика гематолитических показателей крови белых крыс в постнатальном онтогенезе / А. В. Новожилов, Л. Н. Катюхин // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. — 2008. — Т.44, №6. — С. 613—621.
  7. Новицкий, В. В. Патоморфоз эритроцита у больных с приобретенными пороками сердца и в условиях их хирургической коррекции / В. В. Новицкий, Н. В. Рязанцева, Ю. Ю. Вечерский, О. И. Липицкая, Е. А. Степанова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2004. — Т. 137, №3. — С.336—340.
  8. Ронин, В.С. Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований // В.С. Ронин, Г.М. Старобинец // Москва. Изд-во «Медицина», 1989. — 320 с.
  9. Тризно, Н.Н. К вопросу о моделировании эколого-патологического состояния — токсического отека легких / Н.Н. Тризно // Медико-биологические аспекты адаптации // Астрахань. Изд-во Астраханской государственной медицинской академии, 1996. — С.121—135.

Literature

  1. Agadzhanjаn, N. A. Fiziologijа cheloveka / N. A. Agadzhanjаn, L. Z. Tel', V. I. Cirkin, S. A. Chesnokova  // Sankt-Peterburg. Izd-vo «SOGIS», 1998. S. 500—503.
  2. Bondar', T. P. Laboratornajа gemocitologijа: metody issledovanijа i kliniko-diagnosticheskoe znachenie izuchenijа yеritrocitov / T. P. Bondar', O. I. Zaporozhceva, T.V. Karchinskajа, E. V. Vershak // Stavropol'. Izd-vo  SGU, 2007. — 62 s.
  3. Zinchuk, V. V. Differenciruemost' yеritrocitov: fiziologicheskie aspekty / V. V. Zinchuk // Uspehi fiziologicheskih nauk. — 2001.— T.32, №3. — S. 66—78.
  4. Lazko, A.E. Sostoyanie gazotransportiruyuschego kompartmenta mimtemyi mikrotsirkulyatsii pri vozdeystvii serosoderzhaschego gaza / A.E. Lazko, A.A. Rezaev // Materialyi yubileynoy nauchnoy konferentsii Astrahanskogo gosudarstvennogo meditsinskogo instituta // Astrahan. Izd-vo AGMI, 1993. — S. 179—182.
  5. Leonova, V. G. Analiz yеritrocitarnyh populjаcii v ontogeneze cheloveka / V.G. Leonova //  Novosibirsk. Izd-vo « Nauka», Sibirskoe otdelenie, 1987. — 242 s.
  6. Novozhilov, A. V. Dinamika gematoliticheskih pokazatelei krovi belyh krys v postnatal'nom ontogeneze / A. V. Novozhilov, L. N. Katyuhin // Zhurnal yеvolyucionnoi biohimii i fiziologii. — 2008. — T.44, №6. — S. 613—621.
  7. Novickii, V. V. Patomorfoz yеritrocita u bol'nyh s priobretennymi porokami serdca i v uslovijаh ih hirurgicheskoi korrekcii / V. V. Novickii, N. V. Rjаzanceva, YU.YU. Vecherskii, O. I. Lipickajа, E. A. Stepanova // Byulleten' yеksperimental'noi biologii i mediciny. — 2004. — T. 137, №3. — S.336—340.
  8. Ronin, V.S. Rukovodstvo k prakticheskim zanyatiyam po metodam klinicheskih laboratornyih issledovaniy // V.S. Ronin, G.M. Starobinets // Moskva. Izd-vo «Meditsina», 1989. — 320 s.
  9. Trizno, N.N. K voprosu o modelirovanii ekologo-patologicheskogo sostoyaniya — toksicheskogo oteka legkih / N.N. Trizno // Mediko-biologicheskie aspektyi adaptatsii // Astrahan. Izd-vo Astrahanskoy gosudarstvennoy meditsinskoy akademii, 1996. — S.121—135.

Библиографическая ссылка

Нестеров Ю. В., Теплый Д. Д., Морфофизиологические показатели эритроцитов при оксидативном стрессе на разных этапах онтогенеза // «Живые и биокосные системы». – 2015. – № 11; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-11/article-5.