Репродуктивная функция человека зависит от комплексных, но строго предопределенных гипоталамо-гипофизарно-гонадных взаимодействий. Фолликулогенез рассматривается как постоянный процесс иерархии фолликулов, при котором одновременно происходит рост и созревание одних фолликулов и атрезия других. Почему  в каждом менструальном цикле женщины в развитие вступают в среднем около 30 фолликулов, а продолжает свое развитие только один - доминирующий фолликул, в то время как у других млекопитающих число доминирующих фолликулов в одном цикле  может быть намного больше десяти?  При этом как число одновременно созревающих доминантных фолликулов, так и число детенышей в помете эволюционно закрепленный признак, относящийся к стойким морфо-физиологическим  характеристикам вида. Например, у мыши одновременно овулирует более 8 фолликулов , начиная с 2-х месячного возраста животного, а у человека один  с 12 лет.  Учитывая, что гены основные  которые регулируют время и число созревающих фоллукуллов - альфа цепь гонадотропного гормона (CGA), фолликулостимулирующий гормон (FSHB), лютеинизирующий гормон (LHB) и тиреотропный гормон (TSHB).  практически  одинаковы у всех млекопитающих, а  такие  значительные различия могут найти отражения в системе регуляции этих генов .  Ранее было показано, что некодирующие белок  участки ДНК транскрибируются  и разные типы РНК принимают активное участие в регуляции активности генов, клеточной дифференцировке, апоптозе и других процессах  (ENCODE,2012; Li J., Zhang Z. 2013;  de Hoon M.,.2015).   Некодирующие последовательности имеют огромный потенциал для продвижения нашего полного понимания биологических процессов при нормальном развитии человека и при различных заболеваниях (Kapranov P. e.a., 2010; St Laurent G. et al., 2012;  Chang T. C. et al. 2015).  Однако, многие закономерности функционирования и распределения регуляторных некодирующих белок последовательностей ДНК в геномах эукариот еще  не найдены. Одним из важных регуляторных элементов транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов  является микро РНК,  которая в значительном количестве, как правило,  локализована в интронах и межгенных пространствах генома.   МикроРНК транскрибируется вместе с геном-мишенью и регулирует его экспрессию. Целью данного исследования было изучение особенностей распространения микроРНК вокруг генов гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси  у млекопитающих  с разным числом доминирующих фоликуллов.   Распространенность микро РНК рассматривали в геномах следующих животных с одним доминирующим фолликулом - Homo sapiens, Ovis aries, Bos taurus, Gorilla gorilla, Macaca mulatta , Pan troglodytes  Pongo abelii, Ovis aries. Животных с двумя и более числом доминирующих фолликул - Сanis lupus, Mus musculus, Oryctolagus cuniculus, Sus scrofa , Rattus norvegicus.

Материалы и методы

 В геномах  животных исследовали  локализацию микроРНК в интронах и  цис-регуляторных районах генов - альфа цепи гонадотропного гормона (CGA), фолликулостимулирующего гормона (FSHB), лютеинизирующего гормона (LHB) и тиреотропного гормона (TSHB). Все последовательности были извлечены из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) помощью набора скриптов разработанного нами набора IFITCH. Последовательности микроРНК для поиска гомологов были взяты из базы данных miRBase (http://mirbase.org/). Биоинформационный анализ осуществлялся с помощью GLAM2  и разработанного нами программного обеспечения  Mscanner (Shkurat e.a.,2015).   Результаты первоначального поиска GLAM2 фильтровали с получением только тех последовательностей в которых степень гомологии х нуклеотидов была больше  85 %,   как для пре-микро РНК, так и для зрелой микро РНК.  В таблице 1 показана длина в п.н.  окрестностей  и  генов альфа цепи гонадотропного гормона (CGA), фолликулостимулирующего гормона (FSHB), лютеинизирующего гормона (LHB) и тиреотропного гормона (TSHB).

Таблица 1.

Длина в п.н.  генов CGA, FSHB, LHBTSHB и их окрестностей (межгенное пространство до гена, после гена, интроны и экзоны гена

 у различных млекопитающих

Вид млекопитающего

CGA

FSHB

LHB

TSHB

                     Виды животных с одним доминирующем фолликулом

Homo sapiens     

105017

306072

2322

52641

Bos taurus 

140103

129663

6115

77492

Macaca mulatta

107053

182574

1932

28339

Gorilla gorilla     

106670

319308

-

52535

Pan troglodytes

111105

311556

1787

53594

Pongo abelii

113653

323744

-

29958

Ovis aries  

105186

131798

6576

41600

Виды млекопитающих с двумя и более доминирующими фолликулами

Sus scrofa 

123266

157565

4801

50278

Oryctolagus c.

105889

161692

1413

78572

Rattus norvegicus

24363

299614

3775

72001

Mus musculus

25867

66405

1405

46189

Canis lupus        

128897

151836

7094

45626







 

 Результаты исследований

         В результате биоинформационного анализа на участках с общей длинной более 4 миллионов пар нуклеотидов было обнаружено 5967 совпадений с последовательностями зрелых микроРНК, зарегистрированных в базе данных miRBase.  Зрелые микроРНК (шпильки) обнаружены у всех исследуемых животных.  В цис-регуляторных районах  гена CGA у животных с формированием одного доминантного  фолликула расположено от 167 до 262 зрелых микроРНК, что практически в два раза больше по сравнению с группой животных имеющих два и более одновременно созревающих фолликулов(n=68-130).  В гене FSHB у животных с формированием одного доминантного  фолликула расположено от 267 до 367 зрелых микроРНК, что существенно превышает эти значения  в группе животных  с большим числом доминантных фолликул (n=99- 217).  У всех животных вокруг гена  LHB локализовано от 1 до 9 молекул микроРНК, а вокруг гена  TSHB от 11 до 219,  при  этом не обнаружено зависимости их количества  от числа созревания доминирующих фолликулов (таблица 2) .

Таблица 2.

Число локализованных микро РНК вокруг генов гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси некоторых млекопитающих

 

CGA

FSHB

LHB

TSHB

Виды животных с одним доминирующем фолликулом

Ovis aries  

212

90

13

53

Bos taurus 

242

95

5

75

Macaca mulatta  

157

267

2

84

Gorilla gorilla     

238

361

-

77

Homo sapiens     

262

365

2

85

Pan troglodytes

218

347

3

94

Pongo abelii

260

567

-

129

Виды млекопитающих с двумя и более доминирующими фолликулами

Sus scrofa 

139

99

4

39

Canis lupus        

66

114

9

11

Oryctolagus cun.

97

173

2

79

Rattus norvegicus

68

217

6

212

Mus musculus    

164

105

1

59

 

         Обнаружена высокая корреляция числа микро РНК и  показателями репродуктивной системы  (таблица 3). Расчет коэффициентов корреляции  позволил установить зависимости между числом найденных зрелых микроРНК в окрестностях генов CGA и FSHB и показателями  репродуктивной системы.          Число локализованных молекул микроРНК вокруг гена CGA у всех исследуемых животных  положительно коррелировалось с   продолжительностью беременности  r=0,89; весом при рождении  r= 0,86;  интервалом между родами  r= 0,79 и    с продолжительностью жизни вида  r= 0,7.    Отрицательная корреляция обнаружена с  продолжительностью овуляции(эструса) r=-0,83;  количеством детенышей  в выводке r=-0,82 ; количеством выводков в год r=-0,74.

         Число локализованных молекул микроРНК вокруг гена FSHB  положительно коррелировалось с  возрастом начала  половой зрелости у самок r=0,77;  интервалом между родами, r=0,87;  количеством выводков в год r= 0,74, продолжительностью жизни r=0,79;  продолжительностью цикла r=0,678.

Таблица 3

Коэффициенты корреляции между числом микро РНК в окрестностях генов CGA, FSHB, LHBTSHB и  морфо- физиологическими показателями репродуктивной системы вида

Физиологический показатель

CGA

FSHB

LHB

TSHB

вес (самки) г

0,382

-0,246

0,090

-0,126

продолжительность жизни (лет)

0,708

0,792

-0,191

-0,019

половая зрелость у самок

0,687

0,765

-0,302

0,098

тип цикла

0,480

0,392

-0,251

0,542

продолжительность цикла (дни)

0,566

0,678

-0,123

-0,271

количество выводков в год

-0,743

-0,527

-0,255

0,129

Количество детенышей в выводке

-0,827

-0,491

0,006

0,193

продолжительность овуляции (эструса)

-0,830

-0,532

0,128

0,121

Беременность (дни)

0,890

0,567

-0,066

-0,018

вес при рождении (г)

0,860

0,440

0,314

-0,239

интервал между родами (дни)

0,789

0,867

0,066

0,676

 

         Наибольшее число корреляционных зависимостей между показателями репродуктивной системы и  числом локализованных микро РНК в межгенном пространстве   обнаружено с геном CGA. Ген  CGA  кодирует альфа цепь  для четырех гормонов – фолликулостимулирующего(FSH) , лютеинизирующего  гормона ( LH) ,  тиреотпропного  TSH и хорионического гонадотропина  (CG).  Рассмотрим подробно типы микро РНК локализованные вокруг этого гена.

Вокруг гена CGA  у приматов локализуется более 200 микро РНК.  В таблице 4  представлены наиболее часто встречаемые молекулы.

Таблица 4

Количество молекул  mir-566;  mir-1268;  hsa-mir-3929; hsa-mir-1273e; hsa-mir-5096 локализованных  вокруг гена CGA у приматов


mir-566

mir-1268

hsa-

mir-1273e

hsa-mir-3929

hsa-mir-5096


ptr-mir-566

ppy-mir-566

hsa-mir-566

hsa-mir-1268a

ppy-mir-1268

Gorilla gorilla

1

1

1

1

6

1

3

5

Homo sapiens

0

0

1

3

6

1

2

6

Macaca mulatta

3

3

3

5

6

1

1

8

Pan troglodytes

1

1

1

3

6

2

3

8

Pongo abelii

1

6

1

3

6

2

3

8

 

            Как видно из таблицы у всех исследуемых приматов в межгенном пространстве и интронах мы обнаруживали хотя бы одну  копию зрелого  гена  hsa-mir-566.  Ранее  было показано,   что в интронах приматов  локализуется мотивы гомологичных  последовательностей  шпильки   hsa-mir-566 или hsa-мир-619.  Процент встречаемости hsa-mir-566 от общего числа всех типов миРНК локализованных в интронах генов  человека составлял  45.34% (Hill A. E., Sorscher E. 2012). Высокая  копийность генов hsa-mir-5096 и hsa-mir-1268 была нами обнаружена ранее, при анализе распространенности микро РНК у приматов вокруг генов оси соматоропина  - GH1, GHRH, SST, и  IGF1 (Shkurat T. et al., 2015).  Более вероятно, что специфическое значения для времени и числа созревания фолликулов будут иметь гены микро РНК  hsa-mir-3929; hsa-mir-1273e;  а также другие , которые встречались  однокопийно, и роль которых в регуляции фолликулогенеза необходимо будет подтвердить в дальнейшем экспериментально.

       Открытия в течении последнего десятилетия показывают, что РНК  работает не только  как функциональный  посланник между ДНК и белком, но также участвует в регуляции  и организации генома, в  регуляции экспрессии генов, и ее роль увеличивается с усложнением (увеличением сложности)  организма (Hill A. E. et., 2005) .   Показана  важная роль РНК  в эпигенетических процессах, которые контролируют дифференциацию и развитие. Эти открытия показывают, что РНК, кажется,  играет  центральную роль  в эволюции и онтогенезе человека (Оловников, 2007; 2009) .  Очевидно и  микроРНК выполняют важную регуляторную роль в процессе фолликулогенеза.

         Работа выполнена  на оборудовании ЦКП «Высокие технологии» ЮФУ при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской федерации,  проект RFMEF159414X0002.

Список используемой литературы

  1. Оловников А. М. Роль парагенома в развитии организмов //Онтогенез. – 2007. – Т. 38. – №. 2. – С. 136-158.
  2. Оловников А. М. Биологическая эволюция на основе неслучайной изменчивости, регулируемой организмом //Биохимия. – 2009. – Т. 74. – №. 12. – С. 1722-1728.
  3. Chang T. C. et al. Genome-wide annotation of microRNA primary transcript structures reveals novel regulatory mechanisms //Genome research. – 2015.
  4. Hill A. E., Sorscher E. J. Massive microRNA sequence conservation and prevalence in human and chimpanzee introns //genome. – 2012. – Т. 3079. – №. 32884. – С. 698069.
  5. Kapranov P. et al. The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is' dark matter'un-annotated RNA //BMC biology. – 2010. – Т. 8. – №. 1. – С. 149.
  6. de Hoon M., Shin J. W., Carninci P. Paradigm shifts in genomics through the FANTOM projects //Mammalian Genome. – 2015. – Т. 26. – №. 9-10. – С. 391-402.
  7. St Laurent G. et al. Intronic RNAs constitute the major fraction of the non-coding RNA in mammalian cells //BMC genomics. – 2012. – Т. 13. – №. 1. – С. 504.
  8. Li J., Zhang Z. miRNA regulatory variation in human evolution //Trends in Genetics. – 2013. – Т. 29. – №. 2. – С. 116-124.
  9. Shkurat, T., Romanov, D., Pshenichnyy, E., Ponomareva, N., Alexsandrova, A., Bakhtadze, G., & Lomteva, S. (2015). Prevalence of miRNAs in Introns and Cis-Regulatory Regions of Genes of the Somatotropic Axis in Mammals. //American Journal of Applied Sciences. – 2015. – Т. 12. – №. 1. – С. 1.

 

Библиографическая ссылка

Шкурат Т. П., Романов Д. Е., Пономарева Н. С., Бахтадзе Г. Б., Лянгасова О. В., Тимофеева С. В., Батталов Д. В., Панич А. Е., Капранов Ф., Распространенность микро РНК в интронах и окрестностях генов CGA, FSHB, LHB,  TSHB у млекопитающих с формированием различного числа доминирующих фолликулов // «Живые и биокосные системы». – 2015. – № 14; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-14/article-13