Введение

В предыдущей работе (Усатов и др., 2013) мы привели результаты физиолого-генетического анализа внеядерных пестролистных химер variegated из коллекции хлорофильных мутантов подсолнечника Южного федерального университета. Была подчеркнута уникальность коллекционных форм, которая заключается в том, что все хлорофильные мутанты, с различной степенью выраженности хлорофильных дефектов в течение нескольких десятилетий, получены с помощью N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ) на генетической основе одной инбредной линии. Данное сообщение посвящено изучению генетической природы индуцированных N-нитрозо-N-метилмочевиной мутаций chlorina у коллекционных линий подсолнечника.

Материалы и методы

Объектом исследований служили внеядерные мутанты коллекционных линий chlorina, список которых приведен в конце статьи. Мутантные формы выделены после обработки в различных режимах N-нитрозо-N-метилмочевиной (НММ) подсолнечника линии 3629. Семена линии 3629 были любезно предоставлены нам А. И. Гундаевым в 1966 г. (получена автором из среднеспелой высокомасличной популяции подсолнечника ВНИИМК № 20044 в 1959 г.).

Растения выращивали на полях учебно-опытного хозяйства ЮФУ (п. Недвиговка). Почва — обыкновенный чернозем южно-европейской фации. Для выяснения генетической природы хлорофильных мутаций проводили реципрокные скрещивания мутантов с зелеными растениями линии 3629. Изучали F1-F3 поколения. Методика проведения реципрокных скрещиваний общепринятая. Содержание хлорофиллов в тканях листьев подсолнечника определяли методом (Гавриленко и др., 1975). В промерах в каждом варианте использовали не менее 20 растений. Статистическую значимость результатов оценивали по критерию Стьюдента (Бейли, 1973).

Результаты и их обсуждение

Несмотря на сходство в окраске листьев хлорофильные мутанты chlorina являются неоднородной группой. Некоторые мутантные линии сохраняют желто-зеленую окраску в течение всего периода вегетации. Растения других линий зеленеют к началу цветения, почти не отличаясь в это время по окраске от зеленых растений исходной линии 3629. У некоторых мутантов chlorina проявление мутантного признака наблюдается на более поздней, чем первая пара листьев, фазе развития (Белецкий, 1989). Внешний вид растения линии 3629 и мутанта en:chlorina-5 приведены на рисунках 1, 2.

Рисунок 1 — Растение инбредной линии 3629

Рисунок 2 — Внеядерный хлорофильный мутант enchlorina-5

В таблице 1 суммированы результаты реципрокных скрещиваний 7 линий chlorina с зелеными растениями, свидетельствующие о строго внеядерном характере наследования данных мутаций. Когда в скрещиваниях с мутантами материнским растением является исходная линия 3629, в F1 всегда возникают только зеленые растения. При реципрокных скрещиваниях в F1 представлен исключительно мутантный фенотип. В последующих поколениях F2, F3 ни зеленые, ни мутантные формы не расщепляются.

Таблица 1 — Реципрокные скрещивания мутантов en:chlorina с зелеными растениями исходной линии 3629

Вид скрещивания

Фенотип растенй F1 

Фенотип растенй F2 

зеленые

сhlorina 

зеленые 

сhlorina 

en:chlorina-1 x 3629

3629 x en:chlorina-1

0

42

51

0

0

996

568

0

en:chlorina-2 x 3629

3629 x en:chlorina-2

0

37

41

0

0

583

373

0

en:chlorina-3 x 3629

3629 x en:chlorina-3

0

54

59

0

0

861

601

0

en:chlorina-5 x 3629

3629 x en:chlorina-5

0

57

33

0

0

712

395

0

en:chlorina-6 x 3629

3629 x en:chlorina-6

0

52

31

0

0

691

443

0

en:chlorina-7 x 3629

3629 x en:chlorina-7

0

41

44

0

0

786

412

0

en:chlorina-8 x 3629

3629 x en:chlorina-8

0

35

56

0

0

403

312

0

en:chlorina-14 x 3629

3629 x en:chlorina-14

0

47

59

0

0

603

452

0


Однако не все мутанты en:chlorina проявляют «классические» различия при реципрокных скрещиваниях. Об этом свидетельствуют данные, приведенные в таблице 2.

Таблица 2 — Расщепление гибридов от скрещивания мутантов en:chlorina с зелеными растениями исходной линии 3629

Вид скрещивания

Количество растений F1 

зеленые

chlorina

хantha 

en:chlorina-4 x 3629

3629 x en:chlorina-4

7

15

0

33

0

0

en:chlorina-9 x 3629

3629 x en:chlorina-9

62

21

0

99

0

0

en:chlorina-10 x 3629

3629 x en:chlorina-10

46

76

34

83

0

0

en:chlorina-11 x 3629

3629 x en:chlorina-11

38

12

0

44

0

0

en:chlorina-12 x 3629

en:3629 x chlorina-12

51

39

0

46

0

0


У мутантов chlorina-4; chlorina-9; chlorina-12 в потомстве зеленых растений в F2, после прямых скрещиваний (chlorina х 3629), наблюдается расщепление, сходное с таковым при гибридизации. У мутанта chlorina-10 часть потомcтва зеленых растений F1 (2 из 5 исследованных) остается константным, остальные расщепляются примерно так же как и при гибридизации — 41 зеленых: 59 chlorina: 31 xantha (летали). У мутанта chlorina-11 в потомстве зеленых растений F2 наблюдается расщепление — 206 зеленых: 56 chlorina, а в потомстве зеленых растений F3 — 103 зеленых: 30 chlorina. Интересно, что после обратных скрещиваний растений линии 3629 с этими мутантами (3629 х chlorina) потомство гибридов F1, в последующих поколениях остается константными. На основании полученных результатов данные линии, были отнесены к мутантам, имеющим сложный тип наследования хлорофильного дефекта, обусловленный взаимодействием ядра и цитоплазмы.

Мутанты chlorina различаются между собой, и в первую очередь, отличаются от зелёных растений количеством зелёных пигментов, габитусом и продуктивностью. В таблице 3 приведены морфофизиологические показатели, а также содержание хлорофиллов в листьях растений chlorina. Видно, что все рассматриваемые мутанты это относительно низкорослые, малопродуктивные и мелкосемянные формы с пониженным содержанием хлорофиллов (54,6%-91,6%) по сравнению с зелеными растениями 3629.

Таблица 3 — Морфофизиологическая характеристика внеядерных мутантов chlorine подсолнечника

Линия

Высота, см

Диаметр корзинки, см

Продуктив-ность одного растения, г

Вес 1000 семян, г

Кол-во хлорофилл. а+в, мг/г сух. веса

3629

145,5±1,5

10,9±0,3

34,6±1,6

42,7±1,4

7,52±0,17

en:chlorina-1

102,4±1,7

6,9±0,5

21,0±1,2

24,7±1,8

6,13±0,23

en:chlorina-2

117,9±1,6

7,7±0,4

26,2±2,7

37,4±2,1

6,02±0,33

en:chlorina-3

99,0±2,2

6,1±0,3

14,5±1,9

21,2±2,4

6,19±0,31

en:chlorina-4

112,3±3,6

7,6±0,6

19,7±1,4

29,9±3,0

4,86±0,18

en:chlorina-5

115,9±2,1

8,7±0,4

23,3±3,1

26,1±1,5

5,51±0,11

en:chlorina-6

97,7±1,9

7,2±0,4

20,5±1,5

35,2±0,9

6,91±0,31

en:chlorina-7

110,3±1,5

7,1±0,4

21,5±1,2

30,7±1,2

5,78±0,16

en:chlorina-8

82,4±2,2

4,7±0,6

10,3±2,2

17,2±2,6

5,75±0,56

en:chlorina-9

90,6±2,0

5,1±0,5

12,7±3,1

22,4±2,3

5,51±0,25

en:chlorina-10

109,9±2,4

7,8±0,5

23,7±1,8

33,2±1,5

4,51±0,38

en:chlorina-11

105,1±2,9

7,4±0,3

18,6±2,4

30,7±1,9

4,11±0,37

en:chlorina-12

131,7±2,3

8,1±0,3

25,7±3,2

38,0±2,1

5,44±0,36


Для пестролистных химер подсолнечника было показано, что между количеством хлорофиллов и степенью сформированности внутренней структуры хлоропластов имеется высокая корреляция (Усатов и др., 2004). Эта закономерность наблюдается и у мутантов chlorina. Так, наименьшее количество хлорофиллов содержат растения en:chlorina-11 (табл. 3). Ультраструктурная организация пластид у данного мутанта также имеет наибольшие отклонения от нормы среди других линий chlorina (Усатов и др. 2010).

В норме хлоропласты подсолнечника инцухт-линии 3629 имеют ультраструктуру, характерную для хлоропластов многих высших растений (рис. 3).

Рисунок 3 — Ультраструктура хлоропластов на срезах листьев подсолнечника инбредной линии 3629

Овальные или линзообразные хлоропласты окружены хорошо выраженной двойной мембраной и имеют развитую ламеллярную систему, представленную ламеллами гран и ламеллами стромы. Тилакоидная система занимает всё внутреннее пространство хлоропласта, что свидетельствует о высокой функциональной активности органеллы. В довольно плотном мелкозернистом матриксе хлоропластов можно наблюдать электронно-прозрачные участки, в которых видны рибосомоподобные частицы. На срезах хлоропластов подсолнечника, как правило, в центре локализованы крупные зерна крахмала. Осмиофильные глобулы немногочисленны.

Структурная организация пластид у мутантов chlorina имеет ряд общих различий по сравнению со структурой хлоропластов растений исходной линии 3629 (рис. 4).

Рисунок 4 — Ультраструктура пластид на срезах листьев подсолнечника мутанта chlorina-11

К таким различиям относятся набухание отдельных тилакоидов, вакуолизация некоторых ламелл, менее развитая структура тилакоидов гран и стромы, сниженное количество крахмальных зёрен.

Методом электронного микроскопирования был проведен сравнительный анализ формы и размеров хпДНК линии 3629 и мутантов en:chlorina-5 и en:chlorina-12 (Усатов и др., 2010). Показано, что хпДНК у 3-х исследуемых линий кольцевой формы и находятся в сверхспирализованном и релаксированном состояниях (рис. 5), с контурной длиной 49,2?0,9 ммк; 50,6?1,2 ммк и 49,7?0,6 ммк, соответственно.

Рисунок 5 — Электронная микрофотография кольцевой молекулы хпДНК подсолнечника (инбредная линия 3629)

Следовательно, форма и размер хпДНК двух мутантов en:chlorina на уровне разрешения электронного микроскопирования оказались сходными как между собой, так и по сравнению с контрольной линией.

Для выявления изменений в последовательности нуклеотидов ДНК органелл у мутантов en:chlorina в лаборатории чл.-корр. НАН Беларуси О. Г. Давыденко (Институт генетики и цитологии, НАН Беларуси) был проведен сравнительный электрофоретический анализ рестрикцированной эндонуклеазами пластидной и митохондриальной ДНК, позволяющий проводить исследования на уровне фрагментов (Трибуш, 1999; Triboush et al., 1999).

Сравнительный электрофоретический анализ, рестрицированной 13-ю эндонуклеазными ферментами (BamH I, Bgl II, Bgl III, Bsp 681, EcoR I, Hind III, Hpa I, Pst I, Sac I, Sal I, Sma I, Xba I, Xho I) хпДНК мутантных линий en:chlorina и исходной родительской формы 3629, выявил полиморфизм хпДНК только у одного фермента — Hind III. В электрофоретическом спектре хпДНК у линии en:chlorina-6 исчез фрагмент размером 8,9 т.п.н. и появились два дополнительных, более легких фрагмента — 5,2 т.п.н. и 3,7 т.п.н. Сумма размеров вновь появившихся была приблизительно равна размеру исчезнувшего — 8,9 т.п.н. Это означает, что в 8,9 т.п.н./HindIII-фрагменте хпДНК линии en:chlorina-6, возникла мутация, в результате которой появился новый сайт узнавания (A*AGCTT) для эндонуклеазы Hind III.

Новый сайт для фермента Hind III был обнаружен в рестрикционных спектрах хпДНК еще двух мутантов: en:chlorina-2 и en: сhlorina-7. В хпДНК этих линий возник аналогичный тип перестройки нуклеотидной последовательности: исчез один фрагмент размером 6,7 т.п.н. и появились два дополнительных более легких фрагмента 3,2 т.п.н. и 3,5 т.п.н. Сравнение суммарного размера вновь возникших фрагментов с исчезнувшим, позволяет предположить возникновение мутантного сайта для эндонуклеазы Hind III в. нуклеотидной последовательности фрагмента размером 6,7 т.п.н.

Изменений в последовательности нуклеотидов митохондриальной ДНК у мутантов en:chlorina не обнаружено. Однако полностью исключить наличие точечных мутаций в мтДНК у исследованных мутантных линий нельзя, так как они могут лежать за пределами разрешающей способности использованного метода.

Таким образом, приведенные результаты убедительно подтверждают пластомную природу мутаций en:chlorina у внеядерных мутантов подсолнечника. Следует подчеркнуть, что сходный фенотипический эффект — желто-зеленая окраска листьев — вызывают мутации, локализованные в разных местах хлоропластного генома (Даниленко, Давыденко, 2003). Дальнейший сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов клеточных органелл (пластид и митохондрий) позволит нам локализовать мутации и в других линиях en:chlorina.

Исследование выполнено в рамках темы Министерства образования и науки РФ (№ 4.5642.2011) и при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485).

Каталог хлорофильных мутантов подсолнечника. II. Мутанты еn:chlorina

Мутантная линия,

год получения

Условия обработки мутагеном

Генетическая природа мутации,

ее фенотипическое выражение

En:chlorina-1

1967

0,01 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 24 ч при 220 С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через 10 суток после обработки.

Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-2

1967

Условия обработки НММ как для линии En:chlorina-1

Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-3

1967

Условия обработки НММ как для линии En:chlorina-1

Внеядерный, устойчивый к сульфатному засолению хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-4

1967

0,02 % раствор НММ (pH 7,0); обработка 24 ч при 220 С; соотношение объемов раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через 10 суток после обработки.

Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.

En:chlorina-5

1967

Условия обработки НММ как для линии En:chlorina-4

Внеядерный, засухоустойчивый хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-6

1967

Условия обработки НММ как для линии En:chlorina-4

Внеядерный, устойчивый к хлоридному засолению хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-7

1967

Условия обработки НММ как для линии En:chlorina-4

Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-8

1967

Условия обработки НММ как для линии En:chlorina-4

Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-9

1981

Выделен из М3 поколения химеры Variegated-33

Хлорофильный мутант сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-10

1987

Семянки замачивали в воде без доступа воздуха 24 ч при 20С, затем проращивали при 250С 12 ч на воде и 6 ч на 0,015% растворе НММ; посев в поле через 14 суток после окончания обработки мутагеном.

Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.

En:chlorina-11

1989

Семянки замачивали в воде без доступа воздуха 18 ч при 180С, затем обрабатывали 3 ч 0,001% НММ при 250С и проращивали 6 ч при 250С на 0,015% растворе НММ; посев в поле через 14 суток после окончания обработки мутагеном.

Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.

En:chlorina-12

1985

Семянки замачивали в воде без доступа воздуха 24 ч при 180С, затем проращивали при 250С 6 ч на 0,01% растворе НММ и 0,3% рифампицина; посев в поле через 12 суток после окончания обработки мутагеном.

Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.

En:chlorina-13

2000 

Семянки замачивали в воде без доступа воздуха 20 ч при 18°С, затем последовательно проращивали на воде 1 ч при 40°С, 11 ч при 25°С, 3 ч в 0,015% растворе НММ при 25°С; посев в поле через 12 ч после окончания обработки мутагеном.

Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.

En:chlorina-14

2000 

Семянки замачивали в воде без доступа воздуха 20 ч при 18°С, затем последовательно проращивали на воде 11 ч при 25°С, 1 ч при 40°С, 3 ч в 0,015% растворе НММ при 25°С; посев в поле через 12 ч после окончания обработки мутагеном.

Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.

En:chlorina-15

2000 

Условия обработки НММ как для линии En:chlorina-14

Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.

 

Литература

  1. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М.: Мир. — 1973. — 271с.
  2. Белецкий Ю. Д. Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. Ростов н/Д: РГУ. — 1989. — 80 с.
  3. Гавриленко В. Ф., Ладыгина М. Е., Хандобина Л. М. Большой практикум по физиологии растений. М.: Высшая школа. — 1975. — 392с.
  4. Даниленко Н. Г., Давыденко О. Г. Миры геномов органелл. Минск: Тэхналогiя. — 2003. — 494с.
  5. Трибуш С. О. Изменения геномов органелл пластомных мутантов типа chlorina у подсолнечника (Helianthus annuus): Автореф. дис….канд. биол. наук. Минск: Институт генетики и цитологии, 1999. 20 с.
  6. Усатов А. В., Колоколова Н. С., Рожкова О. К. и др. Хлорофильные мутации подсолнечника, индуцированные N-нитрозо-N-метилмочевиной и особенности их наследования. I. Пестролистные химеры // «Живые и биокосные системы». — 2012. — № 1; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-1/article-8 (12.08.2013)
  7. Усатов А. В., Рассадина В. В., Аверина Н. Г. и др. Структурно-функциональные особенности мутантных пластид внеядерных пестролистных форм подсолнечника // Физиология растений. — 2004. — Т. 53.- С. 175–183.
  8. Усатов А. В., Федоренко Г. М., Устенко А. А. и др. Нехромосомные мутации подсолнечника. Ростов н/Д: ЮФУ. — 2010. — 264 с.
  9. Triboush S. O., Danilenko N. G., Ulitcheva I. I., Davydenko O. G. Location of induced mutations and reversions in the chloroplast genome of Helianthus annuus // Plant Growth Regulation. — 1999. — Vol. 27. — Р. 75–81.

Библиографическая ссылка

Усатов А. В., Колоколова Н. С. , Усатова О. А., Рожкова О. К., Чеснокова Н. А., Федорова М. А. , Усатов Н. А., Плотников В. Г. Хлорофильные мутации подсолнечника, индуцированные N-нитрозо-N-метилмочевиной и особенности их наследования II. Внеядерные мутации en:chlorina // «Живые и биокосные системы». – 2013. – № 3; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-3/article-20