Введение

Литическое действие бактериофагов по отношению к различным штаммам микроорганизмов является одним из основных их биологических свойств. Для определения спектра литического действия бактериофагов традиционно используется ряд стандартных микробиологических методов, таких как: высев на агаризованную среду методом двуслойного агара [1—2], метод «фаговой дорожки» [3—4] и метод реплик [6]. Поскольку процедура определения фагочувствительности культуры клеток достаточно длительна, разработка метода экспрессного анализа чувствительности микробных клеток к бактериофагам является чрезвычайно важной.

Методы электрооптического (ЭО) анализа все чаще находят применение для решения ряда задач микробиологии и биотехнологии. Метод ЭО анализа микробных суспензий основан на регистрации изменения оптических свойств микробной суспензии под влиянием переменного электрического поля. Исследование основано на измерении зарядов, индуцированных электрическим полем, на границе клеточных структур. После взаимодействия зарядов на этой границе с электрическим полем меняется ориентация бактерий в окружающей среде, что приводит к изменению оптических свойств суспензии [7]. Цикл ранних исследований по изучению электрофизических свойств микроорганизмов, выполненный с привлечением бактериальных клеток различной таксономической принадлежности и различных действующих агентов (ксенобиотики, антитела, бактериофаги, антибиотики), убедительно продемонстрировал одну общую закономерность: при отсутствии специфического или неспецифического взаимодействия действующего агента с бактериальными клетками ЭО свойства клеточной суспензии после его добавления остаются неизменными. И наоборот, специфическое взаимодействие вещества с клетками приводит к выраженному изменению величины ЭО свойств клеточных суспензий [8—9].

Цель исследования

Целью работы являлось определение спектра литической активности бактериофагов методом электрооптического анализа клеточных суспензий.

Материалы и методы

Микроорганизмы

В работе использовали штаммы Azospirillum brasilense штаммов Sp7, Cd, Sp107, Br14, KR77, S27, SR55, SR75, Sp245, Jm6B2, S17, A. lipoferum штаммов Sp59b, SR65, RG20a, A. amazonense Am14, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1 и KA3, Escherichia coli штаммов B-878, XL-1, Pseudomonas putida штаммов C-11 и BA-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122, полученные из коллекции культур ИБФРМ РАН.

Условия культивирования микробных клеток

Культуры выращивали в 250 мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB следующего состава (г/л): NaCl (Becton, Dickinson and Company, Франция) — 10,0; пептон (Becton, Dickinson and Company, Франция) — 5,0; дрожжевой экстракт (DIFCO, США) — 5,0. Инкубирование клеток оcуществляли на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при температуре 30±1°С в течение 18 ч.

Определение активности бактериофага методом стекающей капли выполняли путем нанесения бактериофага на газон гомологичных или гетерологичных бактериальных культур методом «фаговой дорожки» или «стекающей капли» [1—2]. Результат считали положительным, если на месте нанесения фага на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него.

Титр бактериофагов определяли методом двухслойного агара по Грациа [1—2].

Подготовка клеток к электрооптическому анализу проводилась, как описано в работе [8].

Электрооптический анализ клеточных суспензий проводили на электрооптическом анализаторе ELOAnalyser (производства EloSystem GbR, Берлин, Германия) при длине волны света 670 нм (относительно вакуума), напряженности электрического поля 93,1 В/см, времени приложения электрического поля 3,0 сек. Объем измерительной ячейки составлял 1 мл, концентрация клеток (в единицах оптической плотности) ОD670 = 0,4–0,42.

Ориентационный спектр был представлен в виде логарифмической зависимости разности значений оптической плотности суспензий dОD, измеренных при распространении пучка неполяризованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля от частоты. Эта разность была нормирована на значение оптической плотности при хаотической ориентации клеток. Для измерений используются относительные единицы, которые с точностью до константы, равной примерно 1—5*10—32 равны анизотропии поляризуемости частиц с размерностью Ф/m2 [7]. Электропроводность воды во всех случаях составляла 1,6 μS/m. Для каждой серии проводилось не менее 5 экспериментов. Для статистической обработки экспериментальных данных использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.

Результаты и обсуждения

Механизм воздействия бактериофагов на микробные клетки обусловлен адсорбцией фага на клеточной поверхности, последующим проникновением фага в клетку, размножением бактериофагов, разрывом оболочки клетки и выходом фага из клетки. Изменение морфологии клеток и нарушения клеточной стенки у чувствительных к бактериофагу микроорганизмов приводят к изменению их электрофизических (ЭФ) свойств. Мы предположили, что изменение ЭФ параметров клеточных суспензий при их инфекции бактериофагами может быть использовано для определения спектра литической активности бактериофагов с помощью метода ЭО анализа микробных суспензий.

В качестве модельных образцов использовали бактериофаг, выделенный из клеток A. brasilense SR75. Основные свойства бактериофага описаны ранее в работе [5]. При изучении селективности исследуемого бактериофага были протестированы следующие виды и штаммы бактерий рода Azospirillum: A. amazonense Am14, A. brasilense штаммы: Sp7, Cd, Sp107, Sp245, Jm6B2, Br14, KR77, S17, S27, SR55, SR75, A. halopraeferans Au4, A. irakense штаммы: KBC1, KA3, A. lipoferum штаммы Sp59b, SR65 и RG20a. Выбор штаммов определялся в соответствии с их таксономическим положением и степенью родства к штамму, из которого был выделен бактериофаг.

Для этого в суспензию клеток, подготовленных для ЭО измерений, вносили бактериофаг из расчета 20 фагов на микробную клетку, при этом время инкубации составляло 10 мин, затем клетки подготавливались и использовались для ЭО анализа.

В результате проведенных исследований было показано, что бактериофаг ΦAb-SR75 способен инфицировать клетки A. brasilense штаммов SR75 (рисунок 1 (А)), Jm6B2 (рисунок 1 (Б)), SR55 (рисунок 1 (В)) и A. lipoferum SR65 (рисунок 1 (Г)), A. brasilense штаммов Br14 (рисунок 1 (Д)) и S27 (рисунок 1 (Е)).

При этом не зафиксировано изменений величины ЭО суспензий клеток A. brasilense штаммов Sp7 (рисунок 2 (А), Cd (рисунок 2 (Б)); Sp107 (рисунок 2 (В)); Sp245 (рисунок 2 (Г)); KR77 (рисунок 2 (Д)), S17 (рисунок 2 (Е)).

При инфекции клеток A. irakense KBC1 (рисунок 3 (А)) и KA3 (рисунок 3 (Б)), A. amazonense Am14 (рисунок 3 (В)) и A. lipoferum RG20a (рисунок 3 (Г)) бактериофагом ΦAb-SR75 зафиксировано изменение величины ЭО сигнала, т. е., данные штаммы являются чувствительными к бактериофагу ΦAb-SR75.

При инфекции клеток A. halopraeferans Au4 (рисунок 3 (Д)) и A. lipoferum Sp59b (рисунок 3 (Е)) изменений величины ЭО сигнала суспензии клеток не зафиксировано, т. е., можно предположить, что клетки данных штаммов являются устойчивыми к инфекции исследуемым бактериофагом.

На следующем этапе работы представляло интерес сравнить результаты, полученные с помощью метода ЭО анализа микробных суспензий с данными, полученными при помощи стандартного микробиологического метода определения спектра литической активности бактериофагов методом «стекающая капля». При сравнении результатов определения селективности бактериофага ΦAb-SR75 по отношению к перечисленным выше штаммам бактерий, полученных с помощью метода ЭО анализа микробных суспензий с данными, полученными с помощью микробиологического метода «стекающая капля», показано, что результаты, полученные двумя независимыми методами, совпадают.

Одним из важных моментов при разработке нового метода является апробация его на нескольких объектах. Поэтому на следующем этапе работы проводились исследования по изучению возможности использования метода ЭО анализа микробных суспензий для определения специфичности действия бактериофага ΦAb-SR75 в отношении микробных клеток Escherichia coli штаммов B-878, XL-1, Pseudomonas putida штаммов C-11 и BA-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122. Условия проведения экспериментов были аналогичны таковым при использовании клеток азоспирилл. Показано, что при инфекции клеток указанных штаммов бактериофагом ΦAb-SR75, изменений величины ЭО сигнала не зафиксировано, следовательно, клетки являются устойчивыми к действию изучаемого бактериофага.

Выводы

Таким образом, показано, что изменения ЭО параметров клеточных суспензий, при их инфицировании бактериофагом, значительно отличаются у чувствительных и устойчивых к бактериофагу микроорганизмов. Сравнительные исследования двух подходов определения спектра литического действия бактериофага ΦAb-SR75, с помощью метода «стекающей капли» и метода ЭО анализа микробных суспензий показывает полное совпадение полученных результатов. Полученные результаты демонстрируют возможность использование метода ЭО анализа клеточных суспензий для определения чувствительности микробных клеток к бактериофагу и определения специфичности действия бактериофага к исследуемой культуре. Традиционные микробиологические методы определения спектра литической активности бактериофагов длительны и трудоемки, поэтому использование метода ЭО анализа клеточных суспензий для оперативного решения данного вопроса имеет большие перспективы, поскольку отличается простотой исполнения, и получение результата достигается в течение короткого времени. Полученные результаты в последующем могут быть использованы для развития нового метода определения специфичности действия бактериофагов в отношении микробных клеток.

Литература

  1. Адамс, М. Бактериофаги. М.: Медгиз. 1961. — 521 с.
  2. Борисов, Л. Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1984. — 256 с.
  3. Григорьева, Т. М., Кузин, А. И., Азизбекян, Р. Р. Умеренные фаги Brevibacillus laterosporus // Биотехнология. 2007. № 4. С. 18—24.
  4. Золотухин, С. Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: дис. докт. биол. наук. Ульяновск, 2007. — 322 с.
  5. Караваева О. А. Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75. дис. … канд. биол. наук. Саратов, 2012. — 173 с.
  6. Манзенюк, О. Ю., Воложанцев, Н. В., Светоч, Э. А. Идентификация бактерий Pseudomonas mallei с помощью бактериофагов Pseudomonas pseudomallei // Микробиология. 1994.Т. 63, вып. 3. — С. 537—544.
  7. Bunin, v. D., Voloshin, A. G. Determination of cell structures, electrophysical parameters, and cell population heterogeneity // J. Colloid Interface Sci. 1996. Vol. 180. P. 122—126.
  8. Guliy, O. I., Ignatov, O. v. , Markina, L. N., Bunin, v. D., Ignatov, v. V. Action of ampicillin and kanamicin on the electrophysical characteristics of Escherichia coli cells //Intern. J. Environ. Anal. Chem. 2005. Vol. 85, No. 12–13. P. 981—992.
  9. Ignatov, O. v. , Guliy, O. I., Bunin, v. D., Ignatov, v. V. Electrophysical analysis of microbial cells and biosensor technology Intern. J. Environ. Anal. Chem. 2005.Vol. 85, N. 9—11, P. 727—740.

Literaturе

  1. Adams, M. Bacteriophages. M. Medgiz. 1961. — 521 p.
  2. Borisov, L. B. Guide to laboratory work in microbiology. 2nd ed., Rev. and ext. M.: Medicine, 1984 — 256 p.
  3. Grigorieva, T. M., Kuzin, AI, Azizbekyan, RR Temperate phages Brevibacillus laterosporus // Biotechnology. 2007. № 4. P. 18–24.
  4. Zolotukhin, S. N. Creation and development of schemes providing diagnostic biologics based on identified and studied bacteriophages enterobacteria: dis. … doctor. biol. sciences. Ulyanovsk, 2007 — 322 p.
  5. Karavayeva OA Detection of bacteria of the genus Azospirillum using bacteriophages isolated from Azospirillum brasilense strains Sp7 and SR75. dis. … candidate. biol. sciences. Saratov, 2012 — 173 p.
  6. Manzenyuk, O. J., Volozhantsev, NV, Candle, EA Identification of the bacteria Pseudomonas mallei using bacteriophages Pseudomonas pseudomallei // Microbiology. 1994.T. 63, № 3. P. 537—544.
  7. Bunin V. D., Voloshin A. G. Determination of cell structures, electrophysical parameters, and cell population heterogeneity // J. Colloid Interface Sci. — 1996. — Vol. 180. — P. 122—126.
  8. Guliy O. I., Ignatov O. V. , Markina L. N., Bunin v. D., Ignatov v. V. Action of ampicillin and kanamicin on the electrophysical characteristics of Escherichia coli cells //Intern. J. Environ. Anal. Chem. Vol. 85, No. 12–13, 2005.P. 981—992.
  9. Ignatov O. V. , Guliy O. I., Bunin V. D., Ignatov V. V. Electrophysical analysis of microbial cells and biosensor technology Intern. J. Environ. Anal. Chem. Vol. 85, N. 9–11, 2005.P. 727—740.

Библиографическая ссылка

Гулий О. И., Павлий С. А., Бунин В. Д., Коннова С. А., Игнатов О. В., Определение спектра литической активности бактериофагов методом электрооптического анализа клеточных суспензий // «Живые и биокосные системы». — 2014. — № 9; URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-9/article-3.